SCALPEL：基于单细胞RNA测序的转录本异构体高精度定量新工具

本研究针对现有单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法在转录本异构体定量中灵敏度低、准确性不足的问题，开发了基于Nextflow的工作流程SCALPEL。该工具通过伪组装策略整合相同细胞条形码（CB）和唯一分子标识符（UMI）的读段，解析3'端scRNA-seq数据中的异构体表达。实验验证表明，SCALPEL在合成数据中灵敏度（r≥0.8）和特异性显著优于Sierra、scAPA等工具，成功捕捉小鼠精子发生中的3'UTR长度动态变化（如Smg7基因异构体转换），并揭示神经分化中miRNA调控的异构体特异性表达（如miR-128-5p靶向异构体下调）。其兼容长/短读长配对数据的特点，为单细胞水平转录后调控研究提供新范式。

　　

论文解读

在生命科学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术已彻底改变我们对细胞异质性的认知，但大多数方法仅关注基因表达水平，而忽略了转录本异构体的多样性。这一盲区严重制约了对转录后调控机制（如可变多聚腺苷酸化（APA））的理解。APA通过选择不同的多聚腺苷酸化位点（PAS），产生具有不同3'非翻译区（3'UTR）或编码序列的异构体，进而调控mRNA稳定性、定位及翻译效率。然而，现有工具因读段覆盖稀疏性导致的低灵敏度、PAS定位不精准等问题，难以准确量化单细胞水平的异构体表达。

为此，德国癌症研究中心（DKFZ）和海德堡大学的研究团队开发了SCALPEL——一款基于Nextflow的创新型工作流程。该工具利用标准3'端scRNA-seq数据（如10x Genomics、Drop-seq），通过三步模块化设计实现异构体定量：首先整合基因组注释与伪体定量数据构建异构体参考集；其次过滤前体mRNA和内部引物（IP）来源的读段；最后通过期望最大化（EM）算法联合建模UMI读段距离分布，生成单细胞异构体数字基因表达矩阵（iDGE）。研究团队在合成数据和真实数据集（小鼠精子发生、人iPSC分化为神经祖细胞NPC）中验证其性能，并探索其在配对长/短读长数据中的应用。成果发表于《Nature Communications》，为单细胞转录组学研究提供了突破性工具。

关键技术方法

SCALPEL的核心技术包括：1) 注释预处理：截断GENCODE注释中转录本最后600 nt序列，保留3'端差异区域；2) 读段预处理：基于CB和UMI分组读段，过滤内含子区、非注释连接及连续腺苷酸（≥6个）上游的潜在IP位点；3) EM算法定量：利用读段与3'末端的经验距离分布计算概率，通过最大似然估计分配异构体表达量。验证阶段采用合成数据（Splatter模拟）、3'RACE实验、配对长读长（PacBio）数据交叉验证。

研究结果

SCALPEL, a new computational tool for isoform quantification

SCALPEL工作流程将传统scRNA-seq基因表达矩阵分解为异构体表达矩阵（iDGE）（图1a）。其伪组装策略显著提升UMI分配准确性：通过联合建模相同UMI的读段与3'末端的全局距离，解决异构体定量中的模糊性问题（图S1）。

SCALPEL shows accurate quantification of isoforms at single-cell resolution

合成数据集测试表明，SCALPEL预测的异构体丰度与模拟值高度相关（Pearson r≥0.8）（图2d-f）。即使低深度数据集（UMI/异构体数减少50%），仍保持稳健性能。

Benchmark of SCALPEL using synthetic data shows higher sen-sitivity and specificity than other tools

相较于基于峰检测的工具（Sierra、scAPA）和异构体定量工具（scUTRquant），SCALPEL灵敏度最高（图2g-i）：在低表达基因中（Q1），其DIU基因检出率（57%）显著优于scUTRquant（19%）。其特异性与工具间一致性达91-95%（图S3g-i），验证了预测可靠性。

SCALPEL predictions on real data are more sensitive and have a high degree of agreement with other tools

在小鼠精子细胞分化数据中，SCALPEL鉴定出51,767个异构体（17,525个基因），DIU基因数量（4,196个）远超其他工具（图S4c-e）。Drop-seq数据（人iPSC→NPC分化）进一步证实其适用性，低深度下仍保持高灵敏度（图S5）。

SCALPEL predictions can be experimentally validated

通过3'RACE验证iPSC/NPC分化中5个预测DIU基因（如EIF1异构体转换），其中3个基因（JPT1等）的异构体表达模式与预测一致（图3e-f），证实SCALPEL的生物学可靠性。

Isoform expression at the single-cell level reflects miRNA function

SCALPEL揭示神经分化中miRNA对异构体的调控：含miR-128-5p等神经相关miRNA靶位点的异构体在NPC中显著下调（FDR<0.05）（图3g），表明APA变化部分受miRNA介导的转录后调控驱动。

SCALPEL isoform quantification recapitulates 3’ UTR shortening during mouse sperm cell differentiation

异构体定量重现精子发生关键事件：1) Smg7基因从长异构体（Smg7-202）向短异构体（Smg7-203）转换（图4f）；2) 拟时序分析显示3'UTR整体缩短（图4g），符合已知生物学规律；3) 80%的APA事件仅改变3'UTR长度（串联APA），20%涉及外显子组成变化（图4e）。

Isoform-based analysis identifies novel cell populations during mouse spermatogenesis

高分辨率聚类发现：基于异构体的分析识别出新型圆形精子细胞亚群RS6（图4h），其标志基因富集于纤毛组装（Dnah3）、细胞器组织等通路（图4i），而基因表达分析未能区分该群体。RS6中543个DIU基因（如Msi2）的长异构体上调，提示其在精子成熟中的功能特异性。

SCALPEL improves isoform quantification of novel isoforms predicted using single-cell long-read sequencing

在配对