分裂sgRNA实现CRISPR-Cas12b可编程调控及microRNA免扩增检测

针对Cas12b系统依赖长链sgRNA（>100 nt）导致的精准调控困难、应用受限问题，研究人员开发了分裂sgRNA新策略（tracrDR+Spacer或tracrRNA+DR+Spacer）。该策略通过通用DR区域（16 nt）的化学修饰（如乙二醛掩蔽或光裂解连接子）实现温度/时间或UV介导的Cas12b活性动态调控，兼容重组酶聚合酶扩增（RPA），成功检测临床血浆样本中的EBV病毒（灵敏度匹配qPCR）。创新性以microRNA（如miR-21）直接替代Spacer区域，无需逆转录或扩增即可实现fM级microRNA检测，为核酸诊断提供新范式。

　　

论文解读

背景：CRISPR-Cas12b的困境与机遇

CRISPR-Cas12b凭借其耐高温（31–67°C）、宽pH耐受性（1.0–12.0）及强生理稳定性（人血浆中12小时活性保留），在分子诊断和基因治疗中展现出独特优势。然而，其功能依赖长度超过100 nt的单链向导RNA（sgRNA），导致合成成本高、化学修饰困难，严重限制了精准调控和临床应用。尤其在等温扩增-CRISPR一体化检测中，Cas12b的顺式切割（cis-cleavage）活性易过早降解扩增模板，而传统sgRNA难以实现活性按需控制。如何突破长度限制、开发灵活调控策略，成为推动Cas12b应用的关键挑战。

中山大学研究人员在《Nature Communications》发表研究，通过创新性分裂sgRNA策略，实现了Cas12b活性的精准调控与microRNA直接检测。该研究结合酶动力学分析、化学修饰及光控技术，构建了可编程的Cas12b系统，并成功应用于病毒核酸和癌症标志物的临床样本检测。

研究方法精要

研究采用四类关键技术：（1）酶动力学分析（Michaelis-Menten）评估分裂sgRNA（tracrDR+Spacer/tracrRNA+DR+Spacer）的反式切割（trans-cleavage）效率；（2）微尺度热泳（MST）和分子动力学模拟（AlphaFold3/GROMACS）解析分裂sgRNA与Cas12b的结合机制；（3）乙二醛（glyoxal）掩蔽通用DR区域（11 nt），通过温度/时间调控Cas12b活性；（4）光裂解连接子（PC linker）构建光控RPA-CRISPR一体化系统，结合14例EBV感染者及12例健康人血浆样本验证临床适用性；（5）以microRNA替代Spacer，通过DNA激活剂（activator）设计实现结直肠癌患者血浆microRNA免扩增检测（n=5健康人+5患者术前/术后样本）。

研究结果

1. 分裂sgRNA的功能等效性

   • 设计两种分裂策略：双组分（tracrDR+Spacer）和三组分（tracrRNA+DR+Spacer）。

   • 反式切割活性与全长sgRNA相当：催化效率（k_cat/K_M）达4.29×10⁴ M^?1 s^?1（tracrDR+Spacer）和4.12×10⁴ M^?1 s^?1（tracrRNA+DR+Spacer）（图2d）。

   • 顺式切割产物减少，降低一体化检测中模板降解风险（图2a, 补充图3-4）。

2. 分裂sgRNA的调控机制

   • MST显示分裂sgRNA与Cas12b结合亲和力降低（K_d：tracrDR+Spacer=1070±100 nM；全长sgRNA=89±9 nM），但更易与靶DNA解离，增强反式切割（补充图5-6）。

   • AlphaFold3模拟揭示：分裂形式诱导Cas12b的REC1区域（100–200残基）构象波动，影响靶标识别（补充图7-8）。

3. 通用检测策略

   • 仅替换Spacer（18–23 nt）即可检测多种病毒：EBV（检测限3.18 pM）、猴痘病毒（MPXV, 3.09 pM）、丙肝病毒（HCV, 12.4 pM）（图3e）。

   • 成功检测结直肠癌标志物SEPT9基因高甲基化（灵敏度0.05%, 5mC/C）（补充图13）。

4. 动态调控新方法

   • 温度/时间调控：乙二醛掩蔽DR抑制Cas12b活性；60°C加热40分钟或37°C孵育24小时可恢复活性（图4b-c, 补充图16）。

   • 光控激活：DR-PC-DNA（连接8 nt随机DNA）完全抑制活性；UV照射（365 nm, 15秒）恢复56.9%顺式切割活性，实现RPA-CRISPR一体化检测（图4d-f）。

   • 临床验证：检测14例EBV血浆样本，结果与qPCR高度一致（R²>0.99）（图4g, 补充图19-22）。

5. microRNA直接检测

   • microRNA（如miR-21）替代Spacer，引导Cas12b切割DNA激活剂，释放荧光信号（图5a）。

   • 高特异性：仅目标microRNA激活系统（miR-21 vs. miR-17/31/92a/4429，前体miR-21无响应）（图5b）。

   • 灵敏度达26.7 fM（miR-21），CRISPR试纸条可检50 fM（图5c-d, 补充图24-25）。

   • 结直肠癌应用：HCT116/SW480癌细胞中miR-21表达显著高于正常肠细胞NCM460；患者术前血浆miR-21水平高于术后及健康人（图5h-j, 补充图27-31）。

6. 单碱基分辨率提升

   • 分裂sgRNA对PAM近端1–7位（M1-7）单点突变（A-T/T-A/G-C/C-G）的鉴别能力优于全长sgRNA（荧光信号差异提高2.23–2.75倍）（图5f-g）。

结论与意义

本研究通过分裂sgRNA策略攻克了Cas12b的sgRNA长度限制难题，实现三重突破：

1. 精准调控：通用DR区域（11 nt）的化学修饰（乙二醛/光裂解 linker）首次实现Cas12b活性按需开关，解决了一体化检测中扩增与CRISPR反应的兼容性问题；

2. 检测革新：以microRNA直接替代Spacer，无需逆转录或扩增即可实现fM级检测，为癌症液体活检提供新工具；

3. 临床应用：成功验证EBV病毒（临床血浆）和结直肠癌标志物（SEPT9甲基化/microRNA）检测，灵敏度匹配金标准qPCR。

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