线粒体mRNA的超分辨率显微成像揭示基因表达调控新机制

本研究通过结合单分子荧光原位杂交(smFISH)与STED/MINFLUX超分辨率显微技术，首次实现了对线粒体mRNA分子及其相关蛋白的纳米级可视化。研究人员开发了特异性探针系统，成功解析了线粒体mRNA的空间分布、构象特征及其在病理条件下的动态变化，为理解线粒体基因表达调控提供了全新视角。该技术可应用于多种细胞类型，为线粒体相关疾病的机制研究开辟了新途径。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其独特的基因组和基因表达系统一直是生命科学研究的重点。然而，由于线粒体尺寸接近传统光学显微镜的衍射极限，其内部mRNA分子的空间分布和动态变化长期处于"黑箱"状态。这个微小细胞器中的基因表达如何被精确调控？mRNA分子如何在有限空间内有序排列？这些基本问题因技术限制而悬而未决。

德国马克斯·普朗克多学科科学研究所(MPI-NAT)和哥廷根大学医学中心的研究团队在《Nature Communications》发表突破性研究，通过创新性地结合单分子荧光原位杂交(smFISH)与两种超分辨率显微技术(STED和MINFLUX)，首次实现了对线粒体mRNA的纳米级成像。这项研究不仅揭示了线粒体mRNA的三维构象和空间分布规律，还发现了其在病理条件下的动态重排，为理解线粒体基因调控提供了全新工具和视角。

研究团队主要运用了三大关键技术：1)设计特异性branched DNA(bDNA)探针系统，实现对不同线粒体mRNA的特异性标记；2)采用受激发射损耗(STED)显微镜进行多色超分辨率成像，解析mRNA的空间分布；3)利用MINFLUX纳米显微镜实现单分子级精度的三维成像，揭示mRNA的纳米级构象。研究还使用了患者来源的携带m.14709T>C突变的成纤维细胞作为疾病模型。

STED显微镜揭示mRNA空间关系
通过优化设计的smFISH探针系统，研究人员成功实现了对MT-ND1、MT-CO3和MT-CYB等线粒体mRNA的同时成像。STED超分辨率图像显示，不同mRNA分子间平均距离约200nm，且与基因在mtDNA上的位置无关，证实了线粒体转录后立即加工的假说。值得注意的是，mRNA荧光斑点的平均直径仅85nm，提示线粒体mRNA存在高度压缩的结构状态。

MINFLUX成像展现mRNA纳米结构
MINFLUX纳米显微镜以单分子精度揭示了mRNA的三维构象。数据显示mRNA呈现从紧凑到延伸的多样化形态，不同mRNA间最小距离仅75-91nm。通过与核糖体蛋白bL12m(MRPL12)的共定位分析，发现mRNA倾向于形成沿线粒体分布的簇状结构，而核糖体分布更为均匀，部分位点显示mRNA与多个核糖体相邻，可能对应翻译活跃的位点。

病理条件下的mRNA动态变化
在PRORP(线粒体RNase P催化亚基)敲除细胞中，观察到mRNA数量显著增加(MT-ND1 mRNA增加2.1倍)并聚集于GRSF1(RNA颗粒标记蛋白)形成的超大结构中。相反，线粒体转录抑制剂IMT1处理导致mRNA数量减少5倍。在凋亡细胞中，首次直接观察到MT-CO1 mRNA通过BAX孔道释放的现象。患者来源的携带tRNA-Glu突变的细胞显示MT-CO1 mRNA减少，伴随核密度增加和GRSF1簇减少，揭示了单点突变对线粒体基因表达的级联影响。

这项研究建立了线粒体mRNA超分辨率成像的技术体系，首次在纳米尺度揭示了线粒体基因表达的空间组织形式。研究发现线粒体mRNA具有高度压缩的构象，其分布不受基因组位置影响，但在病理条件下会发生特异性重排。MINFLUX技术实现了对单分子mRNA构象的解析，而STED技术则适用于大尺度统计分析。该技术平台可广泛应用于线粒体相关疾病的研究，为理解线粒体基因表达调控提供了全新的空间维度。特别值得注意的是，研究揭示了单点突变如何通过影响RNA加工导致线粒体基因表达紊乱，这为相关疾病的精准诊断和治疗靶点开发提供了重要依据。