牛源末端脱氧核苷酸转移酶与大肠杆菌DNA结合蛋白融合酶的设计表达及功能研究

研究人员通过基因融合技术，将牛源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)与大肠杆菌单链DNA结合蛋白(EcSSB)构建融合酶。采用分子动力学模拟和同源建模设计，通过HisTrap HP亲和层析纯化，结合差示扫描荧光法和动态光散射评估热稳定性。研究发现融合后形成同源四聚体，热稳定性提升但核苷酸添加功能减弱，反而表现出3'-端TTP切除活性，为低成本DNA合成及病毒检测提供了新思路。

　　

这项研究展示了基因工程领域的有趣突破。科研团队巧妙地将牛源末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)与大肠杆菌单链DNA结合蛋白(Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein, EcSSB)进行融合表达。通过计算机模拟预测，这种融合蛋白会形成稳定的同源四聚体结构。实验数据证实，融合后的蛋白不仅保持了TdT的基本特性，还展现出意想不到的功能转变——从原本的核苷酸添加酶转变为具有3'-端胸苷三磷酸(TTP)切除活性的特殊酶。

在技术层面，研究采用HisTrap HP亲和层析成功纯化获得四种蛋白：EcSSB(130 mg/L)、TdT(5 mg/L)以及两种不同连接方式的融合蛋白TdT_L1_EcSSB(9 mg/L)和TdT_L2_EcSSB(7 mg/L)。动态光散射分析显示，天然TdT以单体形式存在(半径3.5 nm)，而融合蛋白则形成更大的复合物。特别值得注意的是，EcSSB的融合显著改善了蛋白的热稳定性，这为开发更稳定的分子工具提供了新思路。

这项发现打破了人们对TdT酶传统功能的认知，其独特的核苷酸切除活性在低成本DNA合成、细胞凋亡研究和病毒核酸检测等领域展现出潜在应用价值。虽然融合导致核苷酸添加能力下降，但这种功能转换反而可能开辟新的应用场景，值得进一步探索其分子机制。