基于多克隆抗体的蓖麻毒素与相思子毒素质谱检测技术开发及其在生物样本分析中的应用

本研究针对高毒性蛋白蓖麻毒素(ricin)和相思子毒素(abrin)的检测难题，开发了特异性多克隆抗体(pAB)结合亲和柱色谱与质谱联用技术。研究人员通过设计靶向特异性肽段的pAB，建立无需直接接触毒素的检测方案，在血浆和尿液中实现5 ng/mL的检测灵敏度，为临床中毒诊断提供快速、安全的分析工具。

　　

在生物恐怖威胁和意外中毒事件频发的背景下，蓖麻毒素(ricin)和相思子毒素(abrin)因其极高的毒性（半数致死量LD₅₀分别为22-25 μg/kg和0.1-1 μg/kg）成为公共卫生安全的重要隐患。这两种植物源性毒素通过抑制核糖体功能导致多器官衰竭，但现有检测方法如ELISA存在交叉反应风险，而质谱技术又面临基质干扰和灵敏度不足的挑战。更棘手的是，毒素在生物样本中浓度快速衰减（12小时后血清浓度可低至10 ng/mL），且实验室直接处理活性毒素需严格生物安全防护，极大限制了临床检测的普及性。

德国萨尔大学医学院（Saarland University）的研究团队在《Archives of Toxicology》发表创新成果，通过"以肽代毒"的策略开发了安全高效的检测方案。该研究聚焦三个核心目标：针对abrin-A和ricin特征肽段(C²⁴⁷NPPNANQSPLLIRSIVEKSKI²⁶⁸和C²⁹¹VYRCAPPPSSQFSLLIR³⁰⁷)制备兔源多克隆抗体；建立基于磁性微珠的免疫亲和富集方法；最终通过两种质谱工作流程验证其在临床样本中的应用价值。

关键技术方法包括：

1. 通过肽阵列进行抗体表位作图验证pAB特异性
2. 将pAB偶联至Protein A/G磁珠构建亲和柱
3. 采用nanoLC-timsTOF（纳升液相-捕获离子淌度飞行时间质谱）分析疑似中毒患者样本
4. 开发LC-Orbitrap（液相色谱-轨道阱质谱）快速检测流程，6分钟内完成分析

抗体开发与表征
通过序列比对选定abrin-A和ricin中心区域的免疫优势表位，合成的22肽和17肽经KLH载体蛋白偶联后免疫家兔。肽阵列实验显示pABAbrin特异性识别包含C²⁴⁷NPPN²⁵¹关键表位的4个重叠肽段，而pABRicin精准结合含P²⁶²PSSQF²⁶⁷中和表位的区域。抗体效价测试确定25 μg/100 μL为最佳工作浓度，磁珠偶联体可稳定保存6个月。

双路径验证策略
方法A应用于2例临床疑似中毒样本：

• 免疫富集后的血浆/尿液样本经SDS-PAGE分离、胶内胰酶消化
• 通过nanoLC-timsTOF鉴定到27个ricin特征肽段（如K.ILSCGPASSGQR.W）
• 结合ricinine（蓖麻碱）检测确认1例为真实中毒，凸显抗体在复杂基质中的特异性

方法B建立标准化流程：

• 直接富集肽段后LC-Orbitrap分析，总耗时80分钟
• 验证显示5 ng/mL的检测限（LOI），回收率98.2%（CV=6.7%）
• 使用蛋白酶抑制剂采血管可解决肽段稳定性问题（-20°C保存24小时降解<15%）

方法学比较
传统凝胶策略（方法A）虽能实现蛋白水平鉴定，但耗时长达3天；而基于肽段检测的方法B在保持灵敏度的同时，分析效率提升36倍，且仅需常规质谱设备。研究特别指出，abrin-A肽在血浆中易受蛋白酶降解，而ricin肽在4°C和-20°C下稳定性更佳，这对样本运输保存具有重要指导意义。

这项研究开创性地通过合成肽替代完整毒素的策略，突破了高毒性蛋白检测的生物安全限制。所开发的pAB不仅可用于质谱前处理，也为未来免疫检测试剂的开发奠定基础。尤为重要的是，快速检测流程（方法B）使得普通临床实验室也能参与毒素筛查，为突发公共卫生事件的应急响应提供了技术储备。研究者建议后续应扩大临床样本验证，并探索单克隆抗体在超灵敏检测中的应用潜力。