靶向CD20的NAP武装CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤临床前研究中的安全性与疗效评估

本研究针对CD19 CAR-T细胞治疗后复发及CD19阴性肿瘤的临床难题，开发了基于利妥昔单抗靶向CD20的CAR(NAP)-T细胞疗法。研究人员通过体外实验证实CAR20-T细胞可特异性杀伤多种B细胞淋巴瘤细胞系及原代套细胞淋巴瘤细胞，并在免疫健全小鼠模型中验证了NAP武装的CAR20(NAP)-T细胞具有延缓肿瘤生长、延长生存期的效果。安全性评估显示该疗法未引起显著组织病理学改变或细胞因子风暴，为克服CAR-T治疗中的抗原逃逸问题提供了新策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，CD19 CAR-T细胞疗法虽在B细胞恶性肿瘤治疗中取得突破，但约三分之二淋巴瘤患者会出现复发，其中近半数复发肿瘤表现为CD19阴性。这一临床困境亟需开发能克服抗原逃逸的新型免疫疗法。CD20作为B细胞发育全程表达的标志物，在淋巴瘤中保持稳定表达，且利妥昔单抗靶向的表位罕见突变，使其成为理想的替代靶点。同时，幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)因其诱导Th1型免疫应答和招募先天免疫细胞的特性，有望增强CAR-T细胞的旁观者杀伤效应。

瑞典乌普萨拉大学(Uppsala University)的研究团队创新性地将NAP基因整合到靶向CD20的CAR-T细胞中，构建了CAR20(NAP)-T细胞。研究证实该疗法不仅能有效清除CD20阳性肿瘤细胞，还能通过NAP介导的免疫调节作用预防抗原阴性复发。相关成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》期刊，为临床转化提供了重要依据。

关键技术方法包括：1)利用慢病毒载体构建含利妥昔单抗scFv的CD20 CAR-T细胞；2)通过流式细胞术评估CAR表达和细胞表型；3)采用荧光素酶报告系统定量体外细胞毒性；4)建立免疫健全小鼠淋巴瘤模型评估疗效；5)使用全血循环系统模拟人体NAP暴露反应；6)组织病理学分析和血清细胞因子检测评估安全性。研究纳入1例利妥昔单抗治疗失败的套细胞淋巴瘤患者原代细胞进行验证。

【CAR20-T cells efficiently kill CD20-expressing lymphoma cells in vitro】

研究团队设计的CAR20-T细胞采用4-1BB共刺激域，流式检测显示其CAR表达稳定且无耗竭标志物(PD-1/TIM-3/LAG-3)上调。体外实验证明，这些细胞能特异性杀伤DB、U698、Raji和Daudi等CD20⁺淋巴瘤细胞系(存活率<20%)，而对CD20^-的DG75细胞无杀伤作用。值得注意的是，来自利妥昔单抗耐药患者的原代套细胞淋巴瘤细胞也能被高效清除(IFN-γ分泌达1500pg/ml)，证实其临床适用性。

【NAP-armed CAR-T cells targeting CD20 exhibited enhanced anti-tumor efficacy】

在A20-hCD20淋巴瘤小鼠模型中，mCAR20(NAP)-T细胞治疗使50%小鼠获得长期无瘤生存，显著优于Mock-T组(p<0.01)。通过双信号域设计(鼠CD28/CD3ζ)，武装NAP的CAR-T细胞维持了与常规CAR-T相当的体外杀伤力，但体内疗效更持久。异种移植实验进一步显示，人CAR20(NAP)-T细胞可延缓Daudi淋巴瘤生长，部分小鼠获得治愈。

【Treatment-related toxicity was not observed in CAR(NAP)-T cell treated mice harboring lymphoma】

靶向鼠CD19的mCAR19(NAP)-T细胞治疗未引起显著毒性：1)主要器官组织学检查仅发现与治疗无关的心脏瓣膜粘液样变性；2)肝酶(ASAT/ALAT/ALP)波动在2倍以内；3)血清中仅检测到CXCL9/CXCL10/CCL2，且无CRS相关因子(IL-6/IFN-γ)异常升高。这些数据表明系统性NAP释放不会加剧CAR-T细胞毒性。

【Recombinant NAP protein does not cause toxicity in human blood】

全血循环实验显示，25μg/ml NAP(预估临床最高浓度的10倍)仅引起适度细胞因子升高：IL-6(4.3倍)、IL-8(4.4倍)、TNF-α(4.4倍)，远低于阿仑单抗(临床安全药物)的诱导水平。补体激活(C3a/C5a)和免疫细胞(T/NK/B细胞)活化指标均未达病理阈值，血小板CD62P表达也无变化，证实NAP具有可控的免疫刺激性。

该研究突破性地解决了CAR-T治疗中的两大关键问题：靶抗原丢失和肿瘤微环境抑制。通过CD20靶向设计，研究者拓展了CAR-T疗法在CD19阴性复发患者中的应用前景；而NAP的武装则创造了"双保险"机制——既能直接杀伤CD20⁺肿瘤细胞，又能通过招募内源性免疫应答清除抗原阴性克隆。特别重要的是，临床前安全性数据为后续试验扫清了障碍：1)利妥昔单抗scFv未引起靶向毒性；2)NAP的全身暴露风险可控；3)与传统CAR-T相比未增加CRS风险。这些发现为开展CD20(NAP)-T细胞临床试验提供了充分依据，可能改变B细胞淋巴瘤的治疗格局。