多组学解析里氏木霉高活性β-葡聚糖酶突变体育种机制

为解决工业β-葡聚糖酶生产中的低酶活、高成本及稳定性差等问题，新疆农业科学院微生物应用研究所团队通过ARTP（常压室温等离子体）诱变技术获得β-葡聚糖酶活性提升56.23%的里氏木霉（Trichoderma reesei）突变体ARTP-9（酶活达45.12 U/mL），并整合转录组与代谢组分析揭示其调控机制。研究发现，突变体通过上调半纤维素水解酶、海藻糖酶（GH37）及γ-氨基丁酸转氨酶等基因表达，并增加棕榈酸、亚麻酸等代谢物积累，显著增强碳代谢与氨基酸合成通路（如KEGG ko01200），为工业酶制剂理性改造提供新靶点。

　　

论文解读

研究背景与意义

β-葡聚糖酶在啤酒酿造、饲料添加剂及生物燃料领域具有关键作用，但其工业化生产长期面临酶活性低、热稳定性差与成本高的瓶颈。传统微生物育种存在随机性强、机制不明等问题，亟需结合现代组学技术解析高产菌株的分子基础。里氏木霉（Trichoderma reesei）作为安全高效的工业丝状真菌，是β-葡聚糖酶生产的理想宿主，但野生菌株酶活难以满足工业需求。

研究设计与方法

新疆农业科学院微生物应用研究所团队以里氏木霉CICC 2626为出发菌株，采用ARTP诱变技术（处理参数：100 W功率、120 s处理时间、86.96%致死率），结合刚果红-β-葡聚糖透明圈初筛（H/C值>1.2）和摇瓶复筛（β-葡聚糖酶活性检测），获得遗传稳定性优异的突变体ARTP-9。通过非靶向代谢组学（UHPLC-Orbitrap MS检测）和转录组学（Illumina NovaSeq 6000测序）分析96 h发酵菌丝体样本，整合KEGG通路与GO功能富集，挖掘突变体酶活提升的调控网络。

研究结果

1. 突变体筛选与稳定性验证

   经ARTP诱变获得4株正向突变体，其中ARTP-9酶活达45.12 U/mL，较原始菌株提升56.23%。连续传代7次后酶活无显著波动（40.33±0.31 U/mL），而其他突变体（如ARTP-3、ARTP-5）出现表型衰退。

1. 代谢组学揭示关键代谢物变化

   鉴定出23种差异丰度代谢物（DAMs），包括11种上调代谢物（如亚麻酸、牛磺酸、磷酸吡哆醛）和12种下调代谢物（如谷胱甘肽、烟酰胺）。棕榈酸（log2FC=0.76）与牛磺酸（log2FC=0.88）显著积累，可能通过调节内质网体积与氧化应激保护促进蛋白分泌。

1. 转录组学解析基因调控网络

   发现1,793个差异表达基因（DEGs），其中640个上调、1,153个下调。GO富集显示DEGs显著富集于细胞膜组分（GO:0016021）、辅因子结合（GO:0048037）及碳水化合物代谢（GO:0005975）；KEGG分析表明碳代谢（ko01200）与丙酸代谢（ko00640）通路激活。关键上调基因包括：

   • β-1,3-葡聚糖酶基因（GH64, log2FC=4.12）

   • α,α-海藻糖酶基因（GH37, log2FC=2.87）

   • γ-氨基丁酸转氨酶基因（log2FC=2.23）

   • 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（log2FC=1.82）

1. 多组学关联机制模型

   棕榈酸与γ-氨基丁酸转氨酶上调协同增强氨基酸代谢；牛磺酸通过扩大内质网容量促进蛋白折叠；磷酸吡哆醛（PLP）作为辅酶稳定水解酶活性。海藻糖酶（GH37）通过调节渗透压促进β-葡聚糖酶分泌，形成"代谢物-基因-酶活"正向调控环路。

结论与展望

本研究通过ARTP诱变获得高酶活、遗传稳定的里氏木霉突变体ARTP-9，首次整合代谢组与转录组揭示其β-葡聚糖酶增产的双重机制：

1. 代谢重塑：棕榈酸与亚麻酸增强抗氧化损伤能力，牛磺酸扩大蛋白合成产能；

2. 基因协同：GH家族水解酶基因与能量代谢基因（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）共同激活碳通量。

   该成果发表于《Scientific Reports》，为丝状真菌工业酶制剂的分子育种提供多组学设计策略，有望推动生物燃料与饲料工业的酶催化效率升级。未来需进一步验证关键基因（如GH64）在发酵罐规模下的调控稳定性。