胞内病原体效应蛋白PieF通过抑制mRNA降解重编程宿主基因表达的新机制

本研究揭示了嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)效应蛋白PieF通过靶向宿主CCR4-NOT去腺苷酸化酶复合体，特异性抑制NOT7/8亚基活性，阻断mRNA去腺苷酸化过程的全新机制。研究人员运用冷冻电镜技术解析了PieF与NOT7/8的复合物结构，发现其通过空间位阻和催化Mg2+置换双重机制抑制酶活，并破坏功能性CCR4-NOT复合体组装。该研究为理解病原体调控宿主基因表达的进化策略提供了重要见解，发表于《Nature Communications》。

　　

在病原体与宿主的进化军备竞赛中，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)发展出超过300种效应蛋白的"分子武器库"，通过IV型分泌系统注入宿主细胞，精准操控各类生理过程。其中，对宿主基因表达程序的劫持尤为关键——既往研究发现这些细菌效应蛋白能调控miRNA表达、模拟宿主sRNA功能、甚至直接抑制蛋白翻译。然而，在mRNA稳定性调控这一关键环节，病原体如何干预宿主mRNA降解机制仍存在认知空白。

美国国立卫生研究院的研究团队将目光聚焦于CCR4-NOT复合体——这个真核细胞中控制mRNA去腺苷酸化(deadenylation)的核心分子机器。通过系统性研究，他们发现军团菌效应蛋白PieF能以纳摩尔级亲和力特异性结合CCR4-NOT的催化亚基NOT7/8，形成独特的抑制复合物。冷冻电镜结构解析显示，PieF通过β5链和α3螺旋构成双界面结合模式：其K124残基直接侵入NOT7活性中心，取代催化必需的Mg²⁺离子；同时空间位阻阻碍RNA底物接近，并阻断NOT6/6L亚基的结合。这种"分子楔子"策略使CCR4-NOT丧失poly(A)尾缩短功能，导致宿主细胞出现转录组范围的poly(A)尾延长（从54个腺苷酸增至150个），最终引发细胞周期S期阻滞。该成果发表于《Nature Communications》。

研究主要采用冷冻电镜（分辨率2.8-3.5?）解析NOT1:NOT7/8:PieF三元复合物结构，结合等温滴定量热法（ITC）测定结合亲和力（K_d≈24 nM），通过体外去腺苷酸化实验验证酶活抑制（5-6倍抑制率），并利用纳米孔直接RNA测序分析HEK293T细胞中poly(A)尾长度变化。

Legionella pneumophila PieF效应蛋白结合特定CCR4-NOT亚基

研究发现PieF能选择性结合CCR4-NOT的DEDD型去腺苷酸化酶NOT7/8，但不与NOT9模块相互作用。定量质谱数据显示NOT6在细胞中呈现亚化学计量表达，暗示天然条件下存在大量"未配对"的NOT7/8可为PieF提供靶点。

PieF是NOT7/8去腺苷酸化活性的强效特异性抑制剂

体外实验证实PieF对NOT7/8的抑制具有高度选择性，对同类DEDD型核糖核酸酶PARN无影响。ITC测定显示其与NOT7/8的结合亲和力达纳摩尔级（K_d≈24 nM）。值得注意的是，PieF虽不能解离预组装的NOT6:NOT7异源二聚体，但能阻止新复合体形成。

冷冻电镜揭示PieF模拟NOT6/6L抑制NOT7/8的分子机制

高分辨率结构显示PieF通过独特的β-α折叠结构与NOT7/8结合：其α3螺旋的K124与NOT7的D40/D161形成盐桥，置换催化Mg²⁺；β5链则与NOT7的β3链形成反平行β片层。这种结合模式与NOT6/6L的亮氨酸重复结构域存在空间竞争，但PieF额外获得与NOT1 MIF4G结构域形成三元复合物的能力，使CCR4-NOT陷入"功能瘫痪"状态。

C端螺旋通过协同结合增强PieF抑制效果

通过系列点突变验证，发现α3螺旋（K124）和β5链周边残基（T98/F111/R113）构成的协同网络对抑制功能缺一不可。其中K124A突变使抑制效率降低2.5倍，而五突变体（5M）则完全丧失结合能力。

PieF破坏mRNA poly(A)尾调控并阻碍细胞周期进程

纳米孔测序显示PieF过表达使细胞poly(A)尾模态长度从54nt增至150nt，与NOT7 dominant-negative突变体表型一致。流式细胞术证实这种mRNA稳态破坏导致G₀/G₁期细胞减少10%，S期细胞相应增加，揭示病原体通过干预mRNA降解调控宿主细胞周期的全新策略。

这项研究首次阐明病原体效应蛋白通过"分子模仿"策略劫持宿主mRNA降解机器的精确机制。PieF的创新性抑制方式——同时实现催化金属离子置换、活性位点封闭和复合体组装破坏——为设计靶向CCR4-NOT的小分子抑制剂提供了模板。从进化角度看，靶向高度保守的NOT7/8使军团菌能跨物种（从原生生物到人类）干扰宿主基因表达，这种"广谱"干预策略可能解释其广泛的宿主范围。该发现不仅拓展了对病原体-宿主互作认知边界，也为感染性疾病治疗和mRNA代谢调控研究开辟了新视角。