靶向表观基因组编辑实现CAR T细胞中PD-1和LAG-3的持续特异性多重免疫检查点调控

本研究针对CAR T细胞疗法中因免疫检查点上调导致的T细胞耗竭问题，开发了基于TALE的靶向表观基因组编辑技术（DEMs），通过特异性沉默PDCD1和LAG3基因启动子区域，在原发性T细胞和前列腺癌特异性CAR T细胞中实现了持久的多重基因沉默（39天培养期间维持2.7倍PD-1和2.1倍LAG-3表达抑制），且转录组分析显示脱靶效应极小。该技术避免了CRISPR-Cas9的基因毒性风险，为增强CAR T细胞抗肿瘤功能提供了安全可控的新策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，CAR T细胞疗法虽已取得突破性进展，但T细胞耗竭问题始终是制约疗效的"阿喀琉斯之踵"。当CAR T细胞持续暴露于肿瘤抗原时，会像过度工作的士兵一样逐渐"精疲力竭"，表现为增殖能力下降和PD-1、LAG-3等免疫检查点分子上调。传统解决方案如检查点阻断抗体存在全身毒性，而CRISPR基因敲除则可能引发染色体易位等基因毒性风险。如何安全持久地调控多个免疫检查点，成为改进CAR T细胞疗法的关键科学难题。

德国弗莱堡大学医学中心（Medical Center- University of Freiburg）的研究团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表的研究中，创新性地将靶向表观基因组编辑技术应用于CAR T细胞改造。他们设计了一类称为"设计师表观修饰因子"（DEMs）的融合蛋白，将TALE DNA结合域与KRAB抑制结构域及DNMT3A甲基转移酶催化域结合，通过瞬时mRNA电转递送实现"打了就跑"的持续基因沉默。研究团队首先筛选出靶向PDCD1启动子区CRC-C区域（距TSS 1.1kb）的P1#5和靶向LAG3近端启动子区（距TSS 10-150bp）的L3#1作为最优编辑器，随后在原发性T细胞和靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）的CAR T细胞中验证其效果。

关键技术包括：1）基于TALE的DEMs设计构建；2）原代T细胞的mRNA电转递送；3）慢性刺激模型（12天内4轮抗原刺激）；4）全转录组测序分析脱靶效应；5）亚硫酸盐测序检测CpG甲基化水平。所有实验均使用≥3名健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）来源的T细胞。

【DEMs介导原代T细胞中持续的多重表观基因组编辑】

通过周期性TCR刺激（每10天1次）建立长期培养系统，发现双DEM处理组在19天时PD-1⁺和LAG-3⁺细胞比例分别降低2.3倍和2.1倍，且沉默效果持续至39天。亚硫酸盐测序显示靶位点CpG甲基化增加4.9倍（PDCD1）和3.6倍（LAG3），其中PDCD1的CpG#12-13和LAG3的CpG#3-5甲基化程度最高。

【转录组分析证实多重表观基因组编辑的安全性】

RNA-seq分析发现：单DEM处理仅引起32-34个差异表达基因（DEGs），而双DEM处理产生338个DEGs。通过交叉比对发现7个PDCD1-DEM特异性下调基因和8个LAG3-DEM特异性下调基因，其中仅THEMIS基因附近存在预测脱靶结合位点（距TSS 26kb），但未影响邻近1Mb内基因表达。

【CAR T细胞模型中多重表观基因组编辑在抗原刺激下保持稳定】

在PSMA特异性CAR T细胞中，急性刺激（48小时）后PD-1⁺细胞减少2.8倍，慢性刺激（12天4轮）后仍保持2.4倍抑制。与CRISPR编辑组相比，DEM编辑的CAR T细胞扩增能力更强（培养14天后细胞数显著高于CRISPR组），且保持相似的细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）和颗粒酶B分泌水平。

【多重表观编辑的CAR T细胞功能完整且具抗耗竭特征】

在高肿瘤负荷条件下（E:T=1:32），DEM编辑的CAR T细胞显示出更强的肿瘤杀伤能力。记忆亚群分析显示编辑不影响T_scm（干细胞样记忆T细胞）向T_eff（效应T细胞）的分化，且双阴性（PD-1^-LAG-3^-）细胞比例显著增加。

该研究首次证明靶向表观基因组编辑可实现CAR T细胞中多重免疫检查点的持久沉默，且具有三大显著优势：1）"打了就跑"的作用机制避免持续表达毒性；2）DNA甲基化和H3K9me3修饰形成的异染色质结构可抵抗反复抗原刺激导致的基因再激活；3）较CRISPR-Cas9显著降低基因毒性风险。特别值得注意的是，部分沉默（非完全敲除）可能保留生理调控空间，有助于平衡安全性与疗效。这种模块化设计为开发"可定制"的下一代CAR T细胞产品提供了新思路，尤其适用于需要同时调控多个通路的复杂肿瘤微环境。未来研究需在表达PD-L1/MHC II的肿瘤模型中进一步验证功能优势，并探索更多免疫检查点组合编辑的协同效应。