YicC样内切核糖核酸酶CD25890通过降解sRNA SQ528调控艰难梭菌孢子形成的分子机制

本研究揭示了艰难梭菌(Clostridioides difficile)中YicC样内切核糖核酸酶CD25890通过降解小RNA SQ528来延迟孢子形成的新机制。研究人员通过比较转录组学鉴定出CD25890的天然底物SQ528，证明其金属依赖性切割活性，并发现CD25890与多核苷酸磷酸化酶(PNPase)形成功能复合物实现RNA完全降解。该研究首次阐明了YicC家族核糖核酸酶的生理底物及其在孢子形成调控中的作用，为理解艰难梭菌致病机制提供了新视角。

　　

在微生物世界中，艰难梭菌(Clostridioides difficile)是一种令人头疼的肠道病原体，它不仅能在医院环境中长期存活，还会导致严重的抗生素相关性腹泻。这种细菌的"生存秘诀"在于其形成高度耐药孢子的能力，这些孢子不仅是传播媒介，还能携带毒素直接攻击宿主。然而，关于这种致命孢子何时、如何启动形成的调控网络，科学家们仍有许多未解之谜。

来自葡萄牙新里斯本大学Antonio Xavier化学与生物技术研究所(Instituto de Tecnologia Quimica e Biologica Antonio Xavier, Universidade Nova de Lisboa)的研究团队发现了一个关键调控因子——CD25890蛋白。这项发表在《Nucleic Acids Research》的研究首次揭示了这种YicC样内切核糖核酸酶通过降解特定小RNA(sRNA)来延迟孢子形成的精细调控机制，为理解艰难梭菌的致病周期提供了新视角。

研究人员采用了多种关键技术方法：比较转录组学分析鉴定差异表达sRNA；蓝绿温和电泳(BN-PAGE)和分子排阻色谱(SEC)分析蛋白寡聚状态；细菌双杂交系统(BACTH)验证蛋白互作；冷冻电镜(cryo-EM)和AlphaFold2多聚体建模解析蛋白结构；体外核糖核酸酶活性检测；荧光原位杂交(FISH)定位sRNA表达。

sRNA SQ528在CD25890缺失突变体中积累
通过RNA测序比较野生型和ΔCD25890突变体，研究人员发现11种sRNA在突变体中表达上调，其中SQ528位于三羧酸循环氧化阶段酶编码基因与MarR家族转录因子之间。定量PCR证实SQ528在突变体中升高30倍，但启动子活性分析显示转录水平未变，表明CD25890通过降解而非抑制转录来调控SQ528水平。

过表达sRNA SQ528模拟CD25890突变体表型
在营养丰富的SM培养基中，ΔCD25890突变体孢子形成率比野生型高5倍。引人注目的是，当研究人员用四环素诱导启动子过表达SQ528时，突变体的孢子形成率进一步提高了10倍。显微观察发现SQ528过表达主要促进孢子形成的后期阶段，包括母细胞对前孢子的完全包裹和成熟孢子的形成。

CD25890在体内外形成六聚体
通过分子排阻色谱和蓝绿温和电泳，研究人员发现纯化的CD25890主要以约216kDa的六聚体形式存在，这一结果与冷冻电镜观察到的环形结构一致。在艰难梭菌细胞提取物中也检测到类似大小的CD25890复合物，证实六聚体是生理相关形式。

CD25890的N端结构域负责寡聚化
有限胰蛋白酶消化将CD25890切割为稳定的17kDa N端片段(1-151aa)。细菌双杂交实验显示N端和C端结构域都能自我相互作用，但只有N端结构域能独立形成六聚体。C端结构域(152-293aa)则主要呈现单体状态。

CD25890具有金属依赖性核糖核酸酶活性
体外实验证明CD25890能在Mn²⁺存在下切割SQ528。使用双标记荧光底物5'-6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA-3'证实其内切核糖核酸酶活性。保守残基H230、E254和E258的丙氨酸突变会显著降低活性，其中双突变E254A/E258A完全丧失活性，但这些突变体与SQ528的结合反而增强。

冷冻电镜揭示桶状六聚体结构
冷冻电镜二维分类显示CD25890呈环形结构。AlphaFold2多聚体建模预测其具有内部富含正电荷残基的桶状空腔，可能参与RNA结合。N端结构域形成环状排列，而C端结构域则表现出更大灵活性。

CD25890与PNPase形成活性复合物
细菌双杂交和分子排阻色谱证实CD25890与多核苷酸磷酸化酶(PNPase)相互作用，形成约445kDa的复合物。虽然两种酶都能独立降解SQ528，但复合物的降解效率显著提高，15分钟内即可完全降解底物。值得注意的是，CD25890的催化失活变体会抑制PNPase活性，表明二者存在功能协同。

这项研究首次鉴定了YicC家族核糖核酸酶的天然底物，阐明了CD25890通过降解sRNA SQ528调控孢子形成的分子机制。发现CD25890与PNPase形成"降解体"实现RNA完全降解，为理解RNA代谢网络提供了新思路。由于孢子形成是艰难梭菌传播和致病的关键，这些发现可能为开发新型抗感染策略提供靶点。特别是SQ528与代谢调控基因的关联暗示了营养信号与发育转换之间的复杂调控网络，值得进一步探索。