基于N-4-氨基苄基-N'-(2-(2-苯基吡咯烷)-2-氧代乙基)脲立体异构体的亲环蛋白D抑制剂开发与生物活性比较研究

针对亲环蛋白D(CypD)抑制剂研究中立体化学不明确、评价方法不统一的问题，研究人员系统合成了N-4-氨基苄基-N'-(2-(2-苯基吡咯烷)-2-氧代乙基)脲类化合物的纯立体异构体，通过RNase复性实验、差示扫描荧光法(DSF)和等温滴定量热法(ITC)等多技术验证发现，化合物13(R)在所有测试参数上均优于其他小分子抑制剂，且与环孢素A(CsA)效力相当，为线粒体通透性转换孔(mPTP)相关疾病治疗提供了新候选药物。

　　

在细胞能量代谢的精密调控网络中，线粒体作为"能量工厂"扮演着核心角色。其中亲环蛋白D(Cyclophilin D, CypD)作为线粒体基质内的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)，通过调控线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放，直接影响细胞生死抉择。当mPTP异常持续开放时，会导致缺血再灌注损伤、神经退行性疾病等多种病理过程。虽然环孢素A(CsA)作为经典抑制剂已被广泛研究，但其大环肽结构带来的选择性差和药代动力学缺陷促使科学家们寻求更优的小分子抑制剂。

捷克赫拉德茨克拉洛韦大学(University of Hradec Kralove)的研究团队聚焦于最具潜力的N-4-氨基苄基-N'-(2-(2-苯基吡咯烷)-2-氧代乙基)脲类化合物。这类分子虽已被多个课题组报道，但因普遍采用外消旋混合物进行研究，且评价体系各异，导致数据难以横向比较。更棘手的是，这些手性分子可能存在旋转异构现象，使得核磁共振表征复杂化，严重阻碍了构效关系的准确解析。

研究人员采用多学科交叉的研究策略，首先通过计算机辅助设计筛选出文献报道中最具潜力的7个先导化合物(3,4,7,8,10,12,13)，随后运用不对称合成技术制备其纯立体异构体。在技术方法上，创新性地采用正交验证策略：通过RNase复性实验测定PPIase抑制活性，差示扫描荧光法(DSF)检测蛋白热稳定性变化，等温滴定量热法(ITC)定量结合亲和力；在线粒体功能层面，采用钙离子诱导的线粒体"肿胀"实验和钙保留能力(Calcium Retention Capacity, CRC)测定评估mPTP抑制效果；同时以CypA为脱靶指标评价选择性。

【选择/设计小分子CypD抑制剂】部分显示，研究团队不仅重现了文献报道的活性化合物，还通过理性设计扩展了结构多样性。特别针对2-苯基吡咯烷核心结构的手性中心，制备了(R)和(S)构型的纯对映体，解决了既往研究中"旋转异构体导致NMR谱图复杂化"的难题。

【总结】部分的重要发现是，化合物13(R)展现出全方位的优越性：其对CypD的半数抑制浓度(IC₅₀)达纳摩尔级别，与CsA效力相当；DSF实验显示ΔT_m值提升显著，表明能有效稳定CypD三维结构；ITC测得解离常数K_d值证实其强结合力；在功能性CRC实验中，显著提高线粒体钙离子滞留能力。值得注意的是，该化合物对CypA的选择性指数超过100倍，完美规避了CsA的脱靶效应。

这项研究的意义在于：首次建立了N-4-氨基苄基-N'-(2-(2-苯基吡咯烷)-2-氧代乙基)脲类抑制剂的立体结构-活性关系图谱，证实(R)-构型对该类分子与CypD结合至关重要；开发的标准化的多维度评价体系为后续抑制剂研发提供了金标准；化合物13(R)作为兼具高效力和高选择性的化学探针，为研究mPTP相关疾病机制提供了新工具，其小分子特性更具备成药性优势。该成果发表于《Bioorganic Chemistry》，为靶向CypD-mPTP通路的药物开发奠定了坚实基础。