斑马鱼鳃组织谷胱甘肽S-转移酶同工酶对百菌清暴露的响应机制及生物转化作用研究

本研究针对农业杀菌剂百菌清(CLT)的环境污染问题，通过体内外实验结合分子对接技术，首次揭示斑马鱼鳃组织中GSTP和GSTA两种胞质型谷胱甘肽S-转移酶同工酶在CLT代谢中的特异性作用。研究发现10 μg/L CLT暴露可分别于第4天和第7天显著激活GSTP和GSTA活性，分子对接证实二者与CLT存在自发结合(ΔG<0 kcal/mol)，为水生生物抗污染机制研究提供了新靶点。

　　

在农业生产和船舶防污领域广泛使用的有机氯杀菌剂百菌清(Chlorothalonil, CLT)，因其持久性和生物累积性已成为全球性环境污染物。现有研究表明，CLT可通过干扰硫醇基团引发氧化应激，导致从无脊椎动物到哺乳动物的多系统毒性，包括线粒体功能抑制、胚胎发育异常和内分泌紊乱。虽然已知谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)介导的谷胱甘肽(GSH)偶联反应是CLT生物转化的关键途径，但鱼类中具有代谢特异性的GST亚型尚未明确。

针对这一科学问题，巴西佩洛塔斯联邦大学（Universidade Federal de Pelotas）Juliano da Silva Barreto团队创新性地采用"体内-体外-计算"三位一体研究策略。研究人员选择斑马鱼鳃组织——这个直接接触水环境污染物且代谢活跃的器官作为研究对象，聚焦其中高表达的两种胞质型GST同工酶：GSTπ类(GSTP)和GSTα类(GSTA)。通过4/7天梯度浓度(0.1-10 μg/L)CLT暴露实验，结合特异性底物(乙烯乙酸酯EA和7-氯-4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑NBD-Cl)活性检测、qPCR基因表达分析以及分子对接模拟技术，系统揭示了GST亚型在CLT解毒过程中的时空特异性调控规律。

关键技术包括：(1)建立斑马鱼鳃组织GSTP/GSTA特异性活性检测体系；(2)采用CDNB非特异性底物对照验证实验结果；(3)运用Autodock Vina进行CLT与GST同工酶三维结构的分子对接；(4)结合热力学参数(ΔG)评估结合稳定性。实验样本来自实验室培育的成年斑马鱼(AB品系)。

【Experimental design】
研究设计体现多尺度验证思路：首先通过体内实验证实10 μg/L CLT暴露4天可使GSTP活性倍增(p<0.05)，而GSTA活性则在7天后出现4.5倍激增。这种时序差异提示两种同工酶可能在不同暴露阶段发挥解毒作用。

【Results】
活性检测显示：GSTP对EA的特异性催化活性在4天暴露组显著升高2倍，而GSTA对NBD-Cl的活性在7天组提升4.5倍。值得注意的是，gstp1/gstp2和gsta1/gsta2的mRNA水平未见显著变化，表明CLT主要调控翻译后修饰过程。分子对接结果表明：CLT能自发(ΔG<0 kcal/mol)结合两种同工酶的活性口袋，其中GSTP的H-site(疏水底物结合位点)与CLT存在π-π堆叠作用，而GSTA则通过氢键网络稳定复合物。

【Discussion】
该研究首次阐明：(1)GSTP/GSTA活性增强与mRNA表达解耦的现象，可能涉及CLT诱导的蛋白构象变化；(2)两种同工酶对CLT的差异响应时间窗口，反映其在解毒过程中的功能分工；(3)计算模拟揭示CLT可直接结合GST活性中心，为理解代谢特异性提供结构基础。这些发现突破传统CDNB底物法的局限性，为开发基于GST亚型的环境生物标志物奠定理论基础。

【Conclusion】
研究证实斑马鱼鳃组织通过GSTP和GSTA的时序性激活应对CLT暴露，其中GSTP可能负责早期解毒反应，而GSTA参与长期适应。分子对接揭示二者通过不同分子机制(π-π堆叠/氢键)结合CLT，这种亚型特异性为精准评估CLT生态风险提供新视角。论文发表于《Chemico-Biological Interactions》，对指导农药合理使用和水生态保护具有重要价值。