ALOX15功能人源化通过提升RvD5生成缓解小鼠结肠炎但不影响足爪水肿的机制研究

本研究针对哺乳动物ALOX15同源酶在炎症中作用机制的种属差异（小鼠Alox15偏好AA 12-脂氧合，而人ALOX15催化15-加氧），通过CRISPR/Cas9技术构建表达人源化Alox15（Leu353Phe突变）的基因敲入小鼠（Alox15-KI）。研究发现：在DSS诱导的结肠炎模型中，Alox15-KI小鼠因结肠组织RvD5水平显著升高而表现出抗炎保护作用（体重损失减少、病理损伤减轻）；但在CFA足爪水肿模型中无显著差异。该成果为解析ALOX15在炎症中的双重角色提供了遗传学证据，并为靶向SPMs（特化促消退介质）的转化研究优化了动物模型。

　　

研究背景：种属差异困扰下的脂氧合酶之谜

在炎症疾病研究中，脂氧合酶ALOX15一直扮演着矛盾角色——它既能促进炎症消退，又能加剧病理损伤。这种双重身份因哺乳动物间的催化特异性差异而更加复杂：人类ALOX15催化花生四烯酸（AA）生成15-氢过氧化二十碳四烯酸（15-H(p)ETE），而小鼠同源酶Alox15却主要产生12-加氧产物（12-H(p)ETE）。由于15-脂氧合路径更高效合成特化促消退介质（SPMs），传统小鼠模型难以准确模拟人类ALOX15的生物学功能，严重阻碍了转化研究。

研究策略：基因编辑破解种属壁垒

为破解这一难题，德国柏林夏里特医学院（Charité-Universit?tsmedizin Berlin）与波茨坦大学的研究团队采用CRISPR/Cas9技术，构建了携带Leu353Phe突变的Alox15基因敲入小鼠（Alox15-KI）。该突变使人源化小鼠Alox15从12-脂氧合酶转变为15-脂氧合酶（图1验证），从而在遗传背景一致的模型中直接比较催化特异性对炎症的影响。研究通过两种经典模型评估其功能：

• 肠道炎症：葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎

• 外周炎症：弗氏完全佐剂（CFA）诱导足爪水肿

关键技术方法

1. 基因编辑与验证：CRISPR/Cas9介导Alox15 Leu353Phe点突变，通过腹腔灌洗细胞和骨髓细胞离体活性检测验证人源化酶功能（RP-HPLC/手性色谱分析产物谱）。

2. 双炎症模型：

   • DSS模型（1.5%饮水8天）：以体重、结肠长度、组织学评分、促炎基因表达（qRT-PCR）为指标

   • CFA模型（50μg分枝杆菌悬液足垫注射）：以足爪容积、机械/热痛敏（von Frey/Hargreaves测试）、细胞因子表达为指标

3. 脂质组学分析：固相萃取结合LC-MS/MS定量结肠组织40+种氧脂素（oxylipins），包括SPMs（RvD5、Mar-2、NPD-1）和经典介质（LTB4）。

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研究结果：人源化ALOX15的疾病特异性保护

1. 人源化酶成功重塑脂氧合谱系（图1）

• 离体验证：Alox15-KI小鼠腹腔细胞催化AA生成15-HETE比例提升至90%（野生型仅8%），且15-HEPE、17-HDHA等15/17-加氧产物在结肠组织显著升高（*p<0.01）。

• 关键SPMs变化：结肠RvD5水平在Alox15-KI小鼠中持续高于野生型（图6J），而Mar-2因14-HDHA生成受阻显著降低（图6I），证实突变特异性改变SPMs合成能力。

2. DSS结肠炎：RvD5介导的肠炎保护（图2）

• 表型保护：Alox15-KI小鼠体重损失更轻（图2A），结肠缩短程度在恢复期基本逆转（图2B），组织炎症评分降低（图2C）。

• 机制关联：

  • 促炎基因（iNOS、TNFα）表达增幅弱于野生型（图2D-E）

  • RvD5升高与保护表型强相关（*p<0.05），而Mar-2、NPD-1未显示保护效应

  • LTB4（促炎介质）无组间差异，排除ALOX5通路干扰（图6G）

3. CFA足爪水肿：保护作用缺失（图7）

• 足爪肿胀度、机械/热痛敏、促炎因子（iNOS、IL-1β、IL-6）表达在两组间无差异（图7C-J），表明ALOX15人源化对急性外周炎症无调节作用。

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结论与意义：靶向SPMs的精准调控新视角

本研究首次通过基因编辑实现哺乳动物ALOX15功能人源化，揭示两个关键机制：

1. 疾病特异性：人源化ALOX15通过提升结肠RvD5生成缓解DSS肠炎，但对CFA足爪水肿无效，提示其抗炎效应具有组织微环境依赖性。

2. SPMs优先级：RvD5（而非Mar-2或NPD-1）是介导肠炎保护的核心介质，为SPMs的靶向治疗提供新方向。

转化价值：

• 模型革新：Alox15-KI小鼠克服了种属催化差异，成为研究人类ALOX15功能的理想工具。

• 药物研发：针对RvD5合成通路的激动剂或可成为结肠炎治疗新策略。

• 临床启示：ALOX15在炎症中的"双面性"可能源于其产物谱的组织特异性代谢，未来需探索不同SPMs在局部炎症中的协同/拮抗关系。

关键图示