化学环化体外转录RNA探索环状mRNA设计新策略：提升翻译活性与稳定性

研究人员针对当前环状RNA（circRNA）制备方法存在的序列限制、纯化困难和生物活性不足等问题，开发了一种基于乙二胺修饰和氧化还原胺化反应（PORA）的化学环化技术。该技术可实现35-4000 nt长度RNA的高效环化（效率达60%），并首次实现内环N7-甲基鸟苷帽（m7G）和N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等功能修饰的整合。实验证明化学环化mRNA（chem-circRNA）在细胞内具有翻译活性且稳定性显著提升，为circRNA治疗应用提供了化学定义明确的新平台。

　　

在生物医药领域，mRNA技术的突破性进展正重塑治疗格局，但其固有的不稳定性仍是重大挑战。传统线性mRNA易被外切酶降解，而天然环状RNA虽具有卓越稳定性，却面临制备瓶颈——现有酶促环化和核酶自剪接方法存在序列依赖性、副产物多等问题，且难以整合治疗性修饰。更关键的是，当前circRNA的翻译完全依赖内部核糖体进入位点（IRES），这种非经典的翻译机制限制了蛋白产量。如何开发普适性强、可定制化修饰的circRNA制备技术，同时实现帽依赖性翻译，成为领域内亟待解决的科学难题。

波兰科学院有机化学研究所（Institute of Organic Chemistry, Polish Academy of Sciences）的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果，通过巧妙设计"一锅两步"的化学环化策略，成功实现体外转录RNA的高效环化。该技术利用5'端乙二胺（EDA）修饰与3'端高碘酸盐氧化的特异性反应，形成吗啉衍生的核苷酸连接，不仅突破长度限制（最长3893 nt），更首次实现内环m⁷G帽结构的整合。研究证实chem-circRNA在哺乳动物细胞和小鼠模型中均展现持续翻译能力，且内环帽结构可激活经典帽依赖性翻译通路，为circRNA治疗应用开辟新途径。

关键技术包括：1）设计EDA-AG/EP5Cap等转录起始子实现5'端功能化；2）建立氧化还原胺化（PORA）环化体系，针对长链RNA开发DNA支架辅助的构象控制技术；3）优化离子对反相色谱（IP-RP-HPLC）和电洗脱纯化方法；4）通过RNase R抗性实验和FRET探针验证环化效率；5）采用脂质纳米颗粒（LNP）递送系统进行体内外功能验证。

【化学环化方法开发】

研究团队设计两类关键起始子：含乙二胺连接臂的AG二核苷酸（EDA-AG/EP5AG）和帽类似物（EP5Cap）。通过铜催化点击化学合成后，用于体外转录获得5'修饰的前体RNA。关键的环化反应利用高碘酸钠（NaIO₄）氧化3'端核糖形成2',3'-二醛，随后与5'乙二胺发生分子内还原胺化（NaBH₃CN参与），形成稳定的吗啉连接。35 nt模型RNA（RNA01/02）的优化显示，pH 5.6-8.0范围内环化效率稳定（50-70%），二级结构预测证实末端空间接近度是效率决定因素。

【大分子RNA环化突破】

针对276-3893 nt的蛋白编码RNA，引入聚乙二醇延长连接臂（EP5AG）使环化效率达47-60%。发现poly(A)尾会降低环化效率（<5%），通过设计28 nt DNA支架（ON2）使952 nt RNA（RNA11）效率从2%提升至50%。最长3893 nt的新冠疫苗序列（RNA17）环化效率达35%，证实方法的普适性。与T4 RNA连接酶II（40-61%）和PIE自剪接（54%）相比，化学法杂质谱更简单且无需镁离子。

【分析鉴定技术】

建立变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离方案：高交联度（19:1 AA/MBAA）的20%胶分离短RNA，低交联度（38:1）的6%胶适于760 nt RNA。开发离子对反相色谱（IP-RP-HPLC）在60℃下实现800 nt内circRNA纯化，回收率50-70%。RNase H切割实验显示环化产物仅产生单一条带，而线性前体被切割为两个片段，确证环状拓扑结构。

【翻译活性验证】

含EMCV IRES的chem-circRNA（circ(EP5)RNA12）翻译活性与酶促环化产物相当，但添加内环m⁷G帽（circ(EP5Cap)RNA12）使蛋白产量提高4倍。值得注意的是，含m¹Ψ修饰的IRES circRNA丧失翻译活性，但含帽结构的circ(EP5Cap)RNA09仍保持活性（仅降低2倍），证实帽结构可绕过IRES依赖的翻译限制。小鼠实验中，688 nt hEPO编码circRNA（circ(EP5Cap)RNA18）的血浆蛋白水平显著高于线性对照。

【结构-功能关系】

研究发现3'UTR和poly(A)对circRNA翻译的增益有限，而内环帽结构可协同IRES提升表达量6.5-21倍。体外翻译抑制实验显示，m⁷GpsppG可特异性抑制帽依赖性circRNA翻译，证实内环帽与eIF4E（真核翻译起始因子4E）的相互作用。树突状细胞实验表明，含病毒IRES的circRNA会诱发CXCL8分泌，而内环帽结构circRNA免疫原性更低。

这项研究开创性地将化学合成策略应用于全长mRNA环化，解决了传统方法在序列通用性和修饰兼容性上的瓶颈。通过构建内环帽结构，首次实现circRNA的帽依赖性翻译，使m¹Ψ等免疫原性修饰的应用成为可能。建立的DNA支架辅助环化技术和IP-RP-HPLC纯化方案，为工业化生产奠定基础。特别值得注意的是，化学环化产生的吗啉连接在体内展现良好生物相容性，其稳定性优势在hEPO小鼠模型中得到验证。这些突破不仅拓展了circRNA的设计空间，更为肿瘤疫苗、蛋白替代疗法等应用提供了新工具。未来通过优化序列元件（如采用HCV IRES）和连接臂化学，有望进一步释放chem-circRNA的治疗潜力。