基于点击化学级联放大内源性铜积累的共价有机框架纳米系统用于铜死亡癌症治疗

本研究针对铜死亡疗法中外源性铜的系统毒性及癌细胞抗性机制，开发了一种响应型共价有机框架（COF）纳米系统（P1+P2@COF@F127-D）。该系统利用肿瘤微环境高谷胱甘肽（GSH）触发铜转运蛋白抑制剂DC_AC50释放，抑制ATOX1/CCS蛋白以富集内源性Cu+，进而催化前药P1/P2发生铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）反应合成谷氨酰胺酶抑制剂C147。C147耗竭GSH并破坏GSH-Cu复合物，形成“Cu+-GSH”级联放大回路，使游离Cu+提升8倍，同步诱导铜死亡和铜依赖性铁死亡。该策略首次实现无需外源铜的肿瘤选择性铜死亡治疗，为克服癌症耐药性提供新思路。

　　

论文解读

癌症治疗领域长期面临化疗耐药性和系统性毒性的双重挑战。铜死亡（cuproptosis）作为一种新发现的程序性细胞死亡方式，通过铜离子（Cu⁺）诱导脂酰化蛋白异常聚集和线粒体代谢崩溃杀伤肿瘤细胞，但其临床应用受限于外源性铜的毒性和癌细胞自身的铜外排机制。如何在不引入外源铜的前提下，精准激活癌细胞内的铜死亡通路，成为亟待解决的科学难题。

为突破这一瓶颈，天津大学张玉苗团队设计了一种智能响应型共价有机框架（COF）纳米系统（P1+P2@COF@F127-D）。该系统由三部分组成：（1）负载谷氨酰胺酶（GLS1）抑制剂前药P1/P2的GSH响应型二硫键-COF（ss-COF）；（2）通过自降解连接子偶联铜转运蛋白抑制剂DC_AC50的Pluronic F127（F127-D）表面修饰层。在肿瘤微环境中，高浓度GSH触发纳米载体解体，同步释放DC_AC50和前药。DC_AC50靶向抑制癌细胞过表达的铜伴侣蛋白ATOX1和CCS，阻断Cu⁺外排，导致胞内Cu⁺富集。富集的Cu⁺催化P1/P2发生生物正交点击化学反应（CuAAC），原位合成活性分子C147（GLS1抑制剂）。C147显著降低细胞内GSH水平（60%），破坏GSH-Cu复合物形成，进一步增加游离Cu⁺浓度，形成“Cu⁺升高→C147合成→GSH耗竭→Cu⁺再升高”的级联放大回路，最终通过双路径诱导肿瘤细胞死亡。

技术方法亮点

1. 纳米载体构建：基于1,3,5-苯三甲醛（BTA）与4-氨基苯基二硫化物（APD）合成ss-COF载体（直径120 nm），通过孔隙吸附共载P1/P2（负载率23.8%/25.5%）。

2. 功能化修饰：DC_AC50通过硫醇响应型自降解连接子偶联F127，形成F127-D用于COF表面包覆，提升纳米粒水分散性及肿瘤靶向性。

3. 体内外响应验证：采用HPLC、荧光探针（Cu⁺特异性探针）及流式细胞术检测GSH触发的药物释放、CuAAC反应效率及游离Cu⁺动态变化。

4. 细胞死亡机制研究：通过免疫印迹（Western blot）分析关键蛋白（DLAT、FDX1、GLS1）、活性氧（ROS）检测、线粒体膜电位（JC-1探针）及生物透射电镜（Bio-TEM）评估铜死亡与铁死亡协同效应。

5. 体内抗肿瘤评价：建立B16黑色素瘤小鼠模型，通过活体成像、肿瘤体积监测、组织铜/GSH含量检测及免疫组化验证疗效。

研究结果与发现

1. 纳米系统构建与表征

   • 结构验证：ss-COF呈球形（粒径150 nm），具备高比表面积（630 m²/g）和GSH响应性（10 mM GSH下24小时药物释放率>95%）。

   • 级联反应可行性：DC_AC50使癌细胞总铜含量显著提升（图2A），并成功催化胞内CuAAC反应合成C147（HPLC检测到P1/P2转化峰，图2B）。

2. Cu-GSH级联放大机制

   • GSH耗竭与铜积累：P1+P2@COF@F127-D处理组细胞内GSH降低60%（图3B），游离Cu⁺浓度提升8倍（图3D），且非游离态铜占比从85%降至62.5%（图3F）。

   • 协同细胞毒性：级联反应诱导癌细胞凋亡率高达80%（图3H），显著优于单一组分对照组（如无CuAAC或DC_AC50组）。

3. 双路径细胞死亡机制

   • 铜死亡通路：DLAT蛋白寡聚化（图4B）及铁硫簇组装蛋白FDX1表达抑制，导致线粒体TCA循环崩溃（图4E）。

   • 铁死亡通路：Cu⁺通过Fenton样反应催化·OH生成，ROS水平激增（图4A），协同放大杀伤效应。

4. 体内抗肿瘤效能

   • 靶向蓄积：Cy5标记纳米粒在肿瘤部位高效富集（附图S42）。

   • 抑瘤效果：治疗组肿瘤抑制率85%（图5C），肿瘤组织Cu含量提升3倍（图5E），GSH降低50%（图5F），DLAT寡聚化与FDX1下调显著（图5G,H）。

   • 安全性：未观察到明显系统毒性（图5D，附图S44-S46）。

结论与意义

本研究首创了一种基于内源性铜激活的级联放大抗肿瘤策略。通过精准设计GSH响应型COF纳米系统，实现DC_AC50与前药P1/P2的肿瘤特异性共递送，利用Cu⁺触发的CuAAC反应原位合成GLS1抑制剂，形成自增强的“Cu⁺-GSH”代谢干预回路。该策略突破传统铜死亡疗法依赖外源铜的局限，同步激活铜死亡与铁死亡通路，在黑色素瘤模型中展现出高效低毒的治疗效果。其科学价值在于：

1. 机制创新：首次将生物正交化学与铜死亡代谢调控耦合，为癌症治疗提供新范式；

2. 技术突破：COF载体实现药物可控释放与级联反应空间限域，提升治疗精准性；

3. 临床潜力：避免外源铜毒性，为克服肿瘤耐药性及转移复发提供新工具。

   论文发表于《Cell Biomaterials》，为铜死亡疗法的临床转化奠定材料学基础。