动态灌注刺激促进3D人类淋巴微环境模型体外功能化组织样构建及其在慢性淋巴细胞白血病研究中的应用

本研究针对慢性淋巴细胞白血病(CLL)病理机制研究中缺乏动态组织模型的难题，开发了基于灌注式生物反应器的3D淋巴/骨髓微环境模型。通过Spongostan支架结合动态培养系统，成功构建了具有功能性细胞外基质网络和机械应力响应的组织样结构，证实动态条件可显著提升CXCR4/CCR7等关键标志物的表达调控能力，为血液肿瘤微环境互作研究提供了创新平台。

　　

在血液肿瘤研究领域，慢性淋巴细胞白血病(CLL)因其复杂的微环境依赖性一直困扰着科学家。这种恶性肿瘤细胞不仅在外周血循环，更依赖淋巴结(LN)和骨髓(BM)等淋巴组织提供的生存信号。传统二维(2D)培养无法模拟体内三维结构的机械应力，而动物模型又存在种属差异。尤其令人困扰的是，现有模型难以重现血流剪切力对肿瘤细胞归巢(homing)的影响，这直接限制了靶向药物(如BTK抑制剂)的研发效率。

意大利圣拉斐尔科研医院(IRCCS Ospedale San Raffaele)的Dafne Barozzi团队在《Cell Reports Methods》发表的研究，创新性地将硬质明胶支架(Spongostan)与milli-fluidic(毫流体)动态系统结合，成功构建了可循环白血病细胞的功能性淋巴组织模型。该研究证实动态灌注能促进细胞外基质(ECM)沉积和VE-cadherin(血管内皮钙黏蛋白)表达，使MEC1白血病细胞系展现出与临床相似的CXCR4/CCR7趋化因子受体调控模式，为研究肿瘤-微环境互作提供了全新工具。

研究采用计算流体力学(CFD)模拟优化灌注参数，通过SHG(二次谐波成像)和SEM(扫描电镜)表征支架拓扑结构。使用LiveBox生物反应器实现200μL/min的sigmoidal(正弦式)灌注培养，结合共聚焦z-stack(三维堆叠)技术分析细胞空间分布。通过RT-qPCR(实时定量PCR)和流式细胞术检测CXCR4/CCR7等48个临床标志物的动态变化。

【Spongostan提供理想的3D淋巴和骨髓支架支持】
通过液体置换法测定Spongostan孔隙率达76%，压缩模量1kPa(湿态)符合淋巴组织力学特性。SHG成像显示53μm平均孔径的异质网络结构，支持HLF(人淋巴成纤维细胞)与HUVEC(人脐静脉内皮细胞)共培养15天仍保持90%以上存活率。

【计算流体动力学分析支持灌注系统设计】
CFD模拟显示LB2生物反应器在200μL/min流速下产生6.09×10^-8Pa剪切应力。纳米粒子追踪证实细胞趋向性迁移，72小时内83%的MEC1细胞能自主归巢至支架。

【动态刺激增强生理性组织样结构】
核形态计量学显示动态组核球形度降低32%(p<0.01)，核间距集中在10-28μm范围。组织学分析发现动态组ECM沉积量增加2.1倍，形成CD31⁺管状结构。

【灌注3D组织展现更高组织复杂性】
免疫荧光显示动态组PDPN⁺(podoplanin)成纤维细胞形成星状网络，VE-cadherin⁺连接增加4.3倍。RT-qPCR证实LMNA(核纤层蛋白A)表达上调5.8倍(p<0.001)。

【循环CLL细胞归巢并改变功能标志物表达】
流式分析显示动态培养使MEC1细胞的VLA-4(CD49d/CD29)表达升高2.4倍，CD44(透明质酸受体)表达模式更接近患者样本。三维重建捕捉到CD45⁺白血病细胞穿越内皮层的动态过程。

该研究突破性地将动态力学刺激整合到淋巴组织工程中，首次实现白血病细胞在模拟血液循环条件下的持续归巢。特别值得注意的是，模型对CD38⁺/CD49d⁺等预后标志物的重现能力，为个性化药物测试提供了可能。研究者提出的"niche conformation"(生态位构型)培养策略，通过精确控制ICAM-1/VCAM-1(细胞间黏附分子)表达梯度，成功模拟了肿瘤细胞外渗(extravasation)过程。这种可整合多器官循环的系统，有望成为研究血液肿瘤转移机制的新标准平台。