化学嫁接策略实现单碱基分辨率RNA修饰图谱绘制

RNA修饰的低丰度（如m6A仅占未修饰核苷酸的0.01%-0.7%）导致传统间接检测方法（如抗体富集）存在分辨率低、假阳性高等局限。浙江大学团队开发了Graft-seq技术，通过酶促反应在修饰位点（如m6A、m6Am、NAD+）共价嫁接已知RNA分支，利用逆转录跳跃信号精确定位修饰位点。该技术首次实现了转录组范围内mRNA和核非编码RNA中多种修饰的单碱基分辨率图谱绘制，为研究RNA修饰的生物学功能提供了直接、免富集的工具，并有望揭示新型RNA-RNA相互作用。

　　

论文解读

在生命科学领域，RNA修饰（如m⁶A、m⁶Am）通过调控基因表达、RNA稳定性和翻译过程，深刻影响细胞功能与疾病发生。然而，这些修饰的丰度极低（仅占未修饰核苷酸的千分之一至万分之几），传统检测方法如抗体富集（MeRIP）分辨率有限（50-200 nt窗口），而间接测序法（如类亚硫酸氢盐处理）因背景干扰易产生假阳性。如何实现高精度、直接定位RNA修饰位点，成为表观转录组学研究的核心挑战。

针对这一难题，浙江大学的研究团队在《Cell Reports Methods》上发表了创新性技术Graft-seq。该技术通过特异性酶促反应在RNA修饰位点嫁接已知序列的RNA分支，结合逆转录过程中的跳跃信号（jumping signal）精准定位修饰位点（图1A）。研究人员首先验证了该策略的可行性：利用模型RNA（如含人工修饰p⁶A或天然m⁶A的探针），通过点击化学或FTO酶介导的级联反应嫁接RNA分支，并筛选出高效跨桥逆转录酶Maxima H Minus（图1D, 2C）。测序数据显示，逆转录"着陆点"（landing site）集中于修饰位点上游1-2 nt处（图1F, 2E），且化学桥连结构可引发特征性碱基错配（图1G, 2F），从而建立修饰位点与信号的强关联。

关键技术方法

研究通过以下核心步骤实现RNA修饰检测：

1. 修饰特异性嫁接：

   • m⁶A：利用FTO酶将m⁶A氧化为中间产物N⁶-羟甲基腺苷（hm⁶A），再经二硫苏糖醇（DTT）处理生成巯基化dm⁶A，最终通过二苯并环辛炔-马来酰亚胺（DBCO-maleimide）和叠氮修饰RNA分支的点击化学完成嫁接（图2A）。

   • 帽结构m⁶Am/NAD：低浓度FTO选择性作用于m⁶Am帽；NAD帽则通过腺苷二磷酸核糖基环化酶（ADPRC）将烟酰胺替换为3-叠氮丙醇，再嫁接DBCO标记分支（图5A, 6A）。

2. 逆转录跳跃与文库构建：逆转录从嫁接分支启动，"跳跃"化学桥连后着陆于RNA主链（m⁶A）或反向跳跃至分支（帽结构），生成嵌合cDNA（图1A, 5A）。

3. 生物信息学分析：针对m⁶A，通过着陆点上游最近腺苷（≤10 nt）定位位点；针对帽结构，则结合转录起始位点（TSS）数据库过滤假阳性（图3B, S6B）。

核心研究结果

1. m⁶A单碱基图谱绘制

   • 细胞mRNA图谱：在HEK293T、HeLa和小鼠胚胎干细胞（E14）中分别鉴定到13,209、9,258和10,435个高置信m⁶A位点（图3C-E）。修饰富集于终止密码子附近及3'非翻译区（3' UTR）（图3F），且呈现典型DRACH基序（D=A/G/U, R=A/G, H=A/C/U）（图3G）。

   • 核RNA图谱：基于T2T-CHM13基因组，在非核糖体核RNA中鉴定数千个位点（图4A-C），其中395个位于染色质相关RNA（carRNA），包括增强子RNA（eRNA）、启动子相关RNA（paRNA）及重复序列RNA（图4F）。L1转座子和Alu重复序列是修饰热点（图4H-J）。

   • 技术验证：与GLORI、m⁶A-SAC-seq等方法的位点重叠率最高达50%，正交实验（SELECT法）验证8个位点准确性（图3H-I）。

2. 帽修饰精确检测

   • m⁶Am定位：结合m⁷G抗体富集与链霉亲和素纯化，在HEK293T中鉴定2,197个帽m⁶Am位点，呈现BCA基序（B=C/G/U）（图5G-I），与CROWN-seq重叠率达90%（图5K）。

   • NAD帽发现：经mRNA脱帽酶（MDE）预处理去除m⁷G背景，鉴定500个NAD帽位点（图6D-F），相关基因富集于翻译调控通路（图6H）。

结论与意义

Graft-seq通过创新性"化学嫁接-逆转录跳跃"机制，突破了低丰度RNA修饰检测的瓶颈：

1. 技术优势：

   • 直接性：避免抗体非特异性结合或间接法的背景干扰。

   • 高分辨率：单碱基精度定位修饰位点，可解析成簇修饰（如m⁶A聚集于100 nt内，图3K）。

   • 广谱性：成功应用于内部修饰（m⁶A）、帽结构（m⁶Am、NAD⁺）及核非编码RNA。

2. 生物学价值：

   • 首次绘制carRNA的m⁶A图谱，为研究核RNA在染色质调控中的作用提供资源（图4F-J）。

   • 揭示NAD帽基因参与线粒体功能等通路（图6H），拓展RNA帽结构的功能认知。

3. 应用前景：结合代谢标记技术，Graft-seq有望发现新型RNA修饰；其"嫁接"设计还