小樱桃病毒1外壳蛋白基因的克隆及高效多克隆抗体制备与应用研究

本研究成功克隆了小樱桃病毒1（LChV-1）外壳蛋白（CP）基因，通过生物信息学分析筛选出优势抗原表位（27-180位氨基酸），并制备了高效价（1:81,000）多克隆抗体。该抗体在Western blot中可特异性检测重组蛋白及田间感染样本，为LChV-1的快速检测和致病机制研究提供了重要工具。

　　

引言
甜樱桃产业作为“小树种大产业”的典范，在中国种植面积已达20万hm²，占全球1/3。然而由小樱桃病毒1（LChV-1）引起的小樱桃病（LChD）导致果实缩小50%-67%，且可通过嫁接和昆虫（如大青叶蝉）传播，造成毁灭性损失。LChV-1属于长线形病毒科，其17 kb单链RNA基因组编码8个开放阅读框，其中ORF5/ORF6编码外壳蛋白（CP）。

材料与方法
研究团队从山东烟台采集病叶样本，通过RT-PCR克隆获得CP基因（GenBank登录号ON494017）。比对26个LChV-1分离株发现：核苷酸一致性72.59%-99.84%，氨基酸一致性74.26%-100%。其中中国泰安甜樱桃分离株（KR736335）与本研究分离株（LChV-1-CP-YT）氨基酸一致性达100%，而与希腊分离株（HG792420）核酸一致性仅74.07%。

利用DNAStar Protean软件预测显示，CP蛋白27-180位氨基酸区域具有优异的亲水性、抗原性和表面可及性。将该片段克隆至pET-28a-SUMO载体，经0.8 mmol/L IPTG诱导后获得34 kDa可溶性融合蛋白（SUMO-CP_27-180），经125 mmol/L咪唑洗脱纯化得率最高。

免疫学分析
新西兰大白兔经4次免疫后，间接ELISA检测血清效价达1:81,000。Western blot显示：1:3,000稀释抗体可特异性识别重组CP蛋白（46 kDa）和感染叶片样本，与健康样本无交叉反应。值得注意的是，该抗体对澳大利亚李树分离株（LC523024）和西班牙甜樱桃分离株（KX192366）具有相同识别效率，提示其广谱性。

讨论与展望
系统发育分析将26个分离株分为2个组群，中国分离株与西班牙分离株（KX192367）亲缘最近。研究首次发现中国境内LChV-1-CP氨基酸变异可达21.29%（ON494017 vs MK775591），推测基因重组是重要驱动因素。相较于RT-PCR检测，本研究所建血清学方法更适合大规模苗圃筛查，其制备的SUMO标签融合抗原较全长CP更易纯化，成本降低60%。未来可基于该抗体开发胶体金试纸条，实现田间10分钟快速诊断。