弓形虫新型质体膜转运蛋白HAP1和HAP9的表型特征及其在寄生虫生存中的关键作用

本研究针对弓形虫(Toxoplasma gondii)质体(apicoplast)膜蛋白功能未知的问题，通过TurboID邻近生物素标记技术鉴定出HAP1和HAP9两个新型转运蛋白。研究人员发现MFS超家族转运蛋白HAP1和ABC转运蛋白HAP9对寄生虫体外生长和小鼠感染至关重要，其缺失会导致质体结构缺陷和代谢异常。该研究为理解顶复门原虫质体的生理功能提供了新见解，论文发表于《One Health Advances》。

　　

弓形虫作为一种重要的人畜共患病原体，其独特的质体(apicoplast)器官被认为是抗寄生虫药物开发的理想靶点。这个具有四层膜结构的细胞器源自次级内共生事件，虽然丢失了大部分原始基因组，但仍保留了铁硫簇组装(SUF)、II型脂肪酸合成(FAS-II)和甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)等关键代谢途径。然而，质体膜蛋白的组成和功能长期以来是个"黑箱"，特别是那些参与代谢物转运的膜蛋白仍待发掘。

中国农业大学兽医公共卫生安全全国重点实验室的研究人员采用TurboID邻近生物素标记技术，以先前发现的质体膜蛋白AMT1、AMT2、HAP1和HAP9为诱饵，开展了一项系统性研究。通过构建TurboID融合株系并进行蛋白质组学分析，鉴定出31个候选蛋白，其中包括新发现的质体定位膜蛋白HAP51。研究人员特别聚焦于主要易化超家族(MFS)转运蛋白HAP1和ATP结合盒(ABC)转运蛋白HAP9，利用AID诱导降解系统和DiCre-U1系统构建条件性敲除株系，揭示了这两个转运蛋白在寄生虫生命周期中的关键作用。相关成果发表在《One Health Advances》杂志。

关键技术方法包括：(1)TurboID邻近生物素标记技术筛选质体膜蛋白；(2)CRISPR/Cas9基因编辑构建AID诱导降解和DiCre-U1条件敲除株系；(3)免疫荧光和Western blot验证蛋白定位及表达；(4)噬斑实验和细胞内复制实验评估生长表型；(5)透射电镜观察质体超微结构变化；(6)小鼠感染模型评估体内毒力；(7)线粒体膜电位检测和生物素化蛋白分析。

研究结果

Identification of novel apicoplast membrane proteins in T.gondii

通过TurboID融合AMT1、AMT2、HAP1和HAP9进行邻近标记，鉴定出31个候选蛋白，其中14个被所有四种诱饵蛋白共同捕获。免疫荧光证实新发现的HAP51具有质体定位特征，而其他候选蛋白如HAP52-63则定位于相邻结构或胞质中。

HAP1 and HAP9 are essential for T. gondii survival

条件性敲除实验显示，HAP1-AID株系在IAA诱导3小时后蛋白完全降解，而HAP9-U1株系需75小时rapamycin诱导才能有效敲除。噬斑实验表明，敲除HAP1或HAP9导致寄生虫完全丧失体外形成噬斑的能力。三轮回复制实验证实HAP1敲除引发典型的"延迟死亡"现象，而HAP9敲除导致寄生虫快速死亡。

Characterization of phenotypes upon depletion of the apicoplast membrane transport proteins HAP1 and HAP9 in T. gondii

小鼠感染实验显示，HAP1或HAP9敲除株完全丧失致病性，感染小鼠存活超过20天。免疫荧光观察到质体标志物ACP在敲除株中呈现弥散分布，表明质体结构完整性受损。HAP9敲除导致线粒体膜电位显著下降，而HAP1敲除的影响在第二轮回复制周期才显现。生物素化蛋白检测发现HAP9敲除使质体内ACC1的生物素化完全消失，而HAP1敲除的影响具有延迟效应。

Depletion of HAP1 and HAP9 caused different defects in the apicoplast

透射电镜揭示两种转运蛋白敲除导致不同的质体结构缺陷：HAP1敲除使质体膜间隙变得透明，而HAP9敲除导致质体基质透明化且膜结构松散。这些结构异常与各自引起的代谢缺陷表型相一致。

这项研究首次系统鉴定了弓形虫质体膜转运蛋白，并揭示了HAP1和HAP9在维持质体结构和功能中的关键作用。特别值得注意的是，虽然同属质体膜转运蛋白，MFS家族的HAP1和ABC家族的HAP9表现出明显不同的表型特征：HAP1缺失引发典型的延迟死亡，主要影响膜间腔结构；而HAP9缺失导致快速死亡，伴随基质成分丢失和膜结构松散。这些发现不仅丰富了我们对顶复门寄生虫质体生物学的认识，也为开发针对质体代谢通路的抗寄生虫药物提供了新靶点。研究建立的TurboID邻近标记策略为今后研究其他细胞器膜蛋白组学提供了方法学参考。