深度测序揭示胡芦巴miRNA图谱及其调控次级代谢网络的新机制

本研究针对药用植物胡芦巴（Trigonella foenum-graecum）次级代谢调控机制不清的问题，通过高通量测序（NGS）技术首次系统鉴定了379个保守及新型miRNA（含287个保守miRNA和92个新型miRNA），预测了10,313个靶基因，并发现其中15个miRNA直接调控萜类、二萜、泛醌、类胡萝卜素及黄酮类化合物合成通路的关键酶（如查尔酮合成酶CHS、玉米黄质脱氢酶ZDS）。该研究为miRNA介导的转基因技术提升植物药用成分产量提供了新靶点，对开发高附加值药用资源具有重要意义。

　　

论文解读

研究背景：解锁"药食两用瑰宝"的基因密码

胡芦巴（Trigonella foenum-graecum）作为亚非地区传承千年的药食两用植物，其种子富含甾体皂苷、生物碱和黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、降血糖等广泛药理活性。然而，这些药用价值的核心来源——次级代谢产物的合成调控网络，尤其是微型核糖核酸（miRNA）的调控作用始终是未解之谜。传统研究多聚焦于形态标记或转录组分析，而作为基因表达"精密开关"的miRNA，其在胡芦巴次级代谢中的功能几乎空白，严重制约了通过基因工程提升药用成分产量的技术开发。

研究主体与方法创新

为破解这一难题，蒙特雷理工学院（Tecnologico De Monterrey）的研究团队采用多组学整合策略：

1. 样本制备：超市采购胡芦巴种子消毒后，用1/2 MS培养基在25°C光暗交替培养15天，液氮速冻幼苗提取总RNA。

2. 高通量测序：使用Illumina NovaSeq 6000平台构建sRNA文库（QIAseq? miRNA Library Kit），经3'接头修剪和低质量序列过滤（Q<30），获得23,951,014条高质量独特读段。

3. miRNA鉴定：通过miRBase v22比对鉴定保守miRNA；新型miRNA经Mireap_0.22b预测，要求前体MFEI（最小自由能指数）≥0.70以区分其他非编码RNA。

4. 靶基因预测：基于miRanda算法预测靶基因，结合KAAS服务器进行通路富集分析。

5. 实验验证：随机选取13个miRNA（7保守+6新型）通过qPCR（SYBR Green法，U6内参）验证表达模式。

核心发现与结果

1. 胡芦巴小RNA序列特征

• 长度分布：独特读段中24 nt占比最高（19.58%），其次为21 nt（7.76%），符合典型植物miRNA大小特征（图1）。

  

2. 新型与保守miRNA鉴定

• 保守miRNA：51个家族共287个成员，miR159家族表达量最高（96,362 reads），miR156成员最多（28个）（表2、图2）。

  

• 新型miRNA：92个新型miRNA被发现，前体MFEI均值1.01±0.35（如tfo-miRN28-5p读段数最高，达33），其发夹结构经UNAFold验证（图3）。

  

3. 次级代谢通路调控网络

• 靶基因富集：KEGG分析显示"二萜合成"（富集倍数37）、"黄酮合成"（17倍）等通路显著富集（图4）。

  

• 关键调控案例：

  • 萜类骨架合成：保守miR156e/miR156j靶向(E)-4-羟基-3-甲基丁烯二磷酸合酶（MEP途径）。

  • 类胡萝卜素合成：新型tfo-miRN9-3p靶向β-胡萝卜素3-羟化酶（催化虾青素前体）。

  • 黄酮合成：新型tfo-miRN31-3p靶向查尔酮合成酶（CHS），调控黄酮合成第一步（图5）。

    

4. 实验验证

qPCR结果与测序数据高度一致（如miR159a表达显著高于其他miRNA），证实数据可靠性（图6）。

结论与意义

本研究首次绘制胡芦巴miRNA全景图谱，揭示15个关键miRNA通过靶向次级代谢酶（如CHS、ZDS、3"-脱氨基-3"-氧烟胺还原酶）精密调控药用成分合成。其中：

1. 应用突破：发现新型miRNA tfo-miRN31-3p可调控黄酮合成限速酶CHS，为转基因提升黄酮产量提供新靶点；

2. 技术革新：建立MFEI≥0.70的新型miRNA鉴定标准，有效区分其他非编码RNA；

3. 产业价值：靶向泛醌合成的tfo-miRN33-5p等可优化辅酶Q₁₀生产，推动药用植物资源高值化利用。

论文发表于《Plant Growth Regulation》，为次级代谢工程提供了首个胡芦巴miRNA调控数据库（NCBI SRA: SRX25016764），开辟了"miRNA育种"提升药用植物经济效价的新路径。