噬菌体JSS1_004通过激酶-关闭域协同作用拮抗DndBCDE-FGH限制系统的分子机制与工程应用

本研究揭示了噬菌体JSS1_004通过N端激酶域（PK）介导DndFGH复合体磷酸化失活，同时C端关闭域（SO）调控宿主转录重编程的双重抗防御机制。通过构建低毒性突变体（G95V/G200W/N201T/M203T），成功赋予M13噬菌体跨物种抵抗DNA硫修饰（PT）限制系统的能力，为优化噬菌体疗法提供了新型工具。

　　

噬菌体与宿主的分子军备竞赛

在微生物与噬菌体持续演化的战争中，细菌发展出DNA硫修饰（PT）系统DndBCDE-FGH作为关键防御屏障。这项研究聚焦于噬菌体JSS1编码的JSS1_004蛋白如何通过独特双域协同机制突破该防御系统。

激酶与关闭域的不可替代性

JSS1_004作为早期表达基因，其N端激酶域（PK）通过磷酸化DndFGH复合体的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸残基，诱导构象变化使其失活。但基因敲除实验显示，单独缺失PK域（JSS1ΔPK）或C端关闭域（SO，JSS1ΔSO）均导致噬菌体完全丧失抗限制能力，斑块形成效率（EOP）下降>10⁵倍。液体培养中，双域缺失株的宿主生长抑制能力显著弱于野生型JSS1（MOI=0.1时OD₆₀₀差异达3倍），证实双域协同是功能完整的必要条件。

宿主转录组的全局重编程

RNA-seq分析揭示JSS1_004的深远调控网络：

1. 直接抑制dndBCDE-FGH操纵子表达，阻断防御系统再生

2. 下调σ³²/σ²⁴应激通路关键基因（dnaK/dnaJ/groES等），关闭蛋白质质量控制

3. 抑制SOS响应元件（recA/lexA），防止DNA损伤修复

4. 反常上调核糖体亚基基因（LSU-L7/L12，SSU-S6等），劫持翻译机器

ChIP-seq揭示核酸结合特性

通过FLAG标记株的染色质免疫共沉淀，发现JSS1_004广泛结合宿主基因组：

• 优先占据71/84个tRNA基因和15/22个rRNA基因簇

• 在核糖体蛋白编码区（如LSU-L3/L5）形成显著峰

• 调控RNA聚合酶β亚基（rpoC）等转录核心元件

这种非特异性结合模式解释了其全局转录调控能力，尽管未直接结合dnd基因启动子。

低毒性突变体的工程化突破

野生型JSS1_004的强细胞毒性（无法稳定克隆）通过自发突变获得缓解：

• G95V/G200W/N201T/M203T突变体保持完整抗DndFGH功能

• 在pACYC184载体中，1%葡萄糖抑制下仍完全中和限制系统

• M203T诱导后（0.1 mM IPTG）仍导致宿主裂解，显示剂量依赖性毒性

跨物种防御突破

将突变体整合至M13噬菌体基因组（基因II与ori间）：

• M13-KI004_G95V在DndBCDE-FGH存在下效价提升37.68倍

• M13-KI004_M203T形成清晰噬菌斑（野生型M13仅微弱生长）

• 6小时复制量达1.2×10⁸ PFU/mL，较对照高30倍

这项研究不仅阐明双域协同抗防御的分子机制，更通过工程化改造实现毒性-功能解偶联，为设计"超级噬菌体"提供了模块化工具。未来可探索该策略在CRISPR-Cas等其它防御系统的普适性应用。