优化基于固体富集的废水SARS-CoV-2检测方法：PCR抑制与变异株挑战的应对策略

这篇研究通过改进日本废水监测中的固体富集RNA提取方法，系统评估了固体组分中未表征的PCR抑制因子对RT-qPCR的影响，发现简单稀释比商业抑制剂去除试剂更有效。研究同时揭示了奥密克戎变异株导致CDC N1检测灵敏度下降的现象，强调持续质量控制在应对病毒进化中的关键作用。

　　

ABSTRACT

废水监测作为追踪SARS-CoV-2社区传播的重要工具，其固体组分中病毒RNA的检测面临PCR抑制和病毒变异双重挑战。研究团队对日本两座污水处理厂2022年全年的84份固体样本进行分析，发现离心沉淀物中存在特殊抑制因子：商业抑制剂去除试剂效果有限，而10倍稀释可使病毒样颗粒(VLP)回收率从平均2.3%提升至5.6%。更令人意外的是，奥密克戎变异株BA.5.2/BQ.1.1在CDC N1探针区域的双突变(C²⁸³¹¹T和C²⁸³¹²T)导致N1检测信号衰减，而N2引物仍保持稳定灵敏度。

IMPORTANCE

研究首次系统验证了固体组分中未知抑制剂的特性——这些物质既不能被常规去除试剂中和，又不同于液体组分中已知的腐殖酸等抑制剂。通过平行监测植物病毒PMMoV(稳定维持在10⁵ copies/L以上)和VLP-RNA回收率，建立了双重质量控制体系。污泥样本的检出率(92.3%)显著高于进水样本(81.8%)，印证了固体富集方法的优势。

INTRODUCTION

随着WHO宣布COVID-19不再构成国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)，废水监测的价值愈发凸显。研究团队创新性地将脊髓灰质炎环境监测(ES)体系改造用于SARS-CoV-2追踪，但发现固体组分中RNA定量存在显著波动。与传统肠道病毒不同，SARS-CoV-2更易吸附在固体颗粒上，这使得采用RNeasy PowerSoil试剂盒的富集方法成为关键。

MATERIALS AND METHODS

实验设计包含三大创新点：

1. 采样策略：对比合流制(WWTP-A)与分流制(WWTP-B)污水处理厂，每月采集进水和初沉污泥样本

2. 质量控制：引入VLP-RNA作为过程控制，其人工设计的非生物源性RNA序列可避免交叉反应

3. 抑制评估：采用四重方案——原始浓度、10倍稀释、100倍稀释、抑制剂去除试剂及其组合

RESULTS

数据揭示三个关键发现：

1. 稀释效应：100倍稀释使VLP回收率提升至8.37%，但会导致低浓度SARS-CoV-2样本漏检

2. 变异影响：2022年6月后N1检测信号衰减60%，而N2信号与病例数保持显著相关性(Spearman r=0.851)

3. 基质差异：合流制系统的抑制效应更显著，可能与雨水带入的复杂污染物有关

DISCUSSION

这项历时两年的监测研究提出了适应性监测框架：

• 方法学上推荐CDC N2单重检测结合10倍稀释方案

• 质量控制需同时监测PMMoV(评估采样偏差)和VLP-RNA(评估提取效率)

• 强调数学建模的必要性，以校正污水处理厂水力停留时间等混杂因素

研究结果对监测其他包膜病毒(如禽流感病毒、猴痘病毒)具有范式意义，特别是当这些病毒可能通过新型传播途径进入污水系统时。固体富集方法的高灵敏度特性，使其成为未来新发传染病早期预警的有力工具。