单核苷酸突变驱动syp依赖性生物膜形成并促进费氏弧菌定殖的分子机制研究

这篇研究揭示了费氏弧菌(Vibrio fischeri)中一个关键的单核苷酸突变(C/A)如何通过显著提升hnoX-hahK操纵子转录水平，进而激活依赖共生多糖(syp)基因簇的生物膜形成通路。研究发现该突变创造新的转录起始位点，使HahK激酶通过SypF和LuxU双通路激活SypG调控的syp表达，最终增强宿主定殖能力。该发现为理解细菌双组分调控系统(TCS)与群体感应(QS)通路的交叉调控提供了新视角。

　　

Bypass suppressor映射至hnoX启动子区

在探究群体感应调控因子LitR抑制生物膜形成机制时，意外发现携带litR双拷贝的费氏弧菌KV10050菌株经富集筛选后获得抑制突变株KV10708。全基因组测序揭示该突变位于hnoX-hahK操纵子上游73bp处的C74297A点突变。通过构建PhnoX-lacZ报告系统证实，该突变使hnoX-hahK转录水平提升80倍。

Zur抑制hnoX转录

转座子突变筛选鉴定出锌摄取调控因子Zur作为hnoX-hahK的负调控因子。Δzur突变使启动子活性提升约3倍，但远低于C/A突变效应。添加锌离子(1-1.5 mM ZnCl₂)可抑制启动子活性，但Zur缺失对静态培养的生物膜表型无显著影响。

C/A突变创造新启动子

5'RACE实验揭示野生型菌株的转录起始位点位于起始密码子上游19bp处。而C/A突变株产生新的转录起始位点(-61bp)，该位点下游出现包含突变位点的新-10区(T^ATCCT)，上游存在可能的延伸-10区(TGn)和-35区(TTGTTA)。启动子截断实验证实BPROM软件预测的启动子位点不准确。

C/A突变促进生物膜形成

将携带C/A突变的hnoX-hahK操纵子回补至Δ(hnoX-hahK)菌株，可重现强粘性生物膜表型。该表型在静态培养(72h)、震荡培养(24h)和平板培养中均显著增强，且部分依赖钙离子信号。当突变仅作用于hahK时，生物膜形成提前至24h即显现，且产生独特的折叠结构，表明HnoX在实验室条件下不能完全抑制HahK活性。

生物膜形成的调控网络

遗传分析显示C/A突变诱导的生物膜完全依赖sypQ和sypG，但仅部分依赖中央调控因子SypF。ΔsypF突变株仍保留约50%生物膜活性，该残余活性依赖磷酸转移酶LuxU。点突变实验证实HahK的保守天冬氨酸D506对其功能至关重要，排除了HahK直接磷酸化SypG的可能性。

宿主定殖优势

在ΔsypF背景下，携带C/A-hahK等位基因的菌株在24h内即可在幼体夏威夷短尾乌贼(Euprymna scolopes)中占据定殖优势，60%以上动物被该菌株独占性定殖，证实HahK可通过SypF非依赖途径促进宿主共生。

进化分歧的启动子区

对13株费氏弧菌分离株的hnoX启动子区测序发现，ES114和H905在关键C位点与其他菌株存在显著差异：其他乌贼共生株在该位置多为G或T，且-35区呈现T^GT^TG^A变异模式。系统发育树显示该调控区的进化分歧与全基因组分析一致，可能影响不同菌株的生态适应性。

这项研究不仅阐明了单核苷酸突变如何重塑细菌基因调控网络，还揭示了HahK通过SypF和LuxU双通路协调生物膜形成与发光功能的分子机制，为理解微生物共生建立过程提供了新的理论框架。