基于生物过程工程学的蓝藻全分离转化子高效筛选新策略

这篇研究论文创新性地提出了一种利用连续搅拌釜反应器(CSTR)系统进行蓝藻转化子筛选的新方法。针对蓝藻多倍体特性导致的转化子分离难题，研究者将液体培养批量转化与连续流选择系统相结合，通过动态调节停留时间(τ)和抗生素浓度双重选择压力，在2-3周内成功获得完全分离的转化子（包括含抗生素抗性基因smr和酮类胡萝卜素合成基因bkt的品系）。该方法在模式蓝藻集胞藻(Synechocystis) PCC 6803中验证了普适性，为蓝藻基因工程提供了高效稳定的技术平台。

　　

1 引言

蓝藻作为唯一能进行放氧光合作用的原核生物，在生物活性物质可持续生产领域具有重要价值。然而多倍体特性成为基因工程的主要障碍——例如新近从新加坡柔佛河分离的微小聚球藻(Picosynechococcus) sp. PCC 11901和模式物种集胞藻(Synechocystis) sp. PCC 6803，其染色体拷贝数会随生长阶段和磷营养状况动态变化。传统平板反复划线法需耗时数周，且操作强度大。

2 材料与方法

研究采用低磷培养基(MAD_{low P}和BG11_{low P})培养菌株，通过Gibson组装法构建两种转化载体：含壮观霉素抗性基因(smr)的简单载体，以及含β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)与卡那霉素抗性基因(kmr)的复合载体。创新性设计2.3cm×15cm的管式微型反应器系统，通过精密调节进料流速(V?)实现1-10天的停留时间(τ)控制。

3 结果与讨论

3.1 微小聚球藻SmR转化子筛选

在τ=1天起始条件下，14天内完全清除野生型基因组（图4）。吸收光谱显示bKT转化株在500-550nm出现特征吸收峰，薄层色谱(TLC)证实虾青素积累（图S3）。

3.2 半连续培养稳定性

随机挑选的SmR1/4/6克隆在42天无抗生素培养中保持基因组稳定性（图6），OD₇₅₀监测显示持续生长（图S4）。

3.3 集胞藻验证实验

中性位点(ns)插入kmr的转化子经21天筛选达到完全分离（图S5），较微小聚球藻更长的选择周期可能与其更高染色体拷贝数相关。

4 结论

该CSTR系统通过τ与抗生素浓度的协同调控，实现了17-28代内完成转化子纯化。特别值得注意的是，系统筛选的转化株已预先适应连续培养条件，这对光生物反应器规模化应用具有独特优势。研究为多倍体微生物的基因编辑提供了普适性解决方案，相关技术参数（如磷限制培养、CO₂补加策略）对同类研究具有重要参考价值。