RNA干扰沉默保幼激素相关基因导致海绵蛾蜕皮失败与高死亡率研究

本研究通过RNA干扰(RNAi)技术靶向沉默海绵蛾(Lymantria dispar)保幼激素(JH)合成通路关键酶JHAMT和代谢酶JHEH基因，系统揭示了其对昆虫生长发育的调控机制。实验采用显微注射法递送双链RNA(dsRNA)，证实2 μg剂量可显著抑制目标基因表达（最高达96%），导致幼虫体长/体重下降30%、头壳宽度缩减26%，并引发蜕皮障碍（死亡率91%）和羽化畸形。该研究为开发特异性RNAi生物农药提供了重要靶点，对解决传统化学杀虫剂抗性难题具有重要应用价值。

　　

摘要

海绵蛾作为全球性多食性害虫，其幼虫阶段可对600余种植物造成毁灭性危害。传统化学杀虫剂存在成本高、非特异性等问题，而基于RNAi的生物防治策略展现出独特优势。研究聚焦保幼激素(JH)代谢通路中两个关键酶——合成途径的JH酸甲基转移酶(JHAMT)和降解途径的JH环氧化物水解酶(JHEH)，通过系统性的基因沉默实验揭示了其对海绵蛾发育的调控机制。

材料与方法

实验从四川紫霞山采集卵块，在25±1°C恒温条件下人工饲养。采用RT-qPCR技术分析基因时空表达谱，通过Megascript RNAi试剂盒合成靶向dsRNA，使用汉密尔顿微量注射器对4龄幼虫进行1-3 μg梯度剂量注射。监测指标包括基因沉默效率、生长发育参数（体长/体重/头壳宽度）、蜕皮/化蛹/羽化率等，所有数据经GraphPad进行单因素方差分析(ANOVA)。

蛋白理化性质

生物信息学分析显示，LdJHAMT（271个氨基酸）分子量为32.18 kDa，等电点5.38，不含信号肽和跨膜结构域，二级结构以α-螺旋为主(49.26%)。LdJHEH（486个氨基酸）则具有典型跨膜结构域，其环氧水解酶功能域(EHN)位于87-198位氨基酸区间，三级结构与家蚕JHEH同源性达48.92%。

时空表达模式

发育阶段表达谱显示：Ldjhamt在5龄幼虫期表达量达峰值（较卵期高15倍），而Ldjheh在6龄期表达最高。组织分布上，两者均在脂肪体呈现优势表达（占比超50%），其中Ldjheh在中肠也有较高表达，这为后续RNAi靶向递送提供了理论依据。

RNAi干扰效应

剂量效应实验表明：2 μg dsRNA注射24 h后，Ldjhamt和Ldjheh表达分别下降85%和94%。值得注意的是，Ldjheh沉默效果更持久，72 h仍保持96%抑制率。形态学观察显示，处理组出现典型发育异常：新旧表皮同时存在的"蜕皮卡壳"现象（发生率67%）、蛹体头胸融合畸形（体色加深30%），以及成虫翅片萎缩（面积减少40%）。

生长发育影响

2 μg处理组数据显示：幼虫体长最大缩减28.8%（5龄期），体重下降60.7%，发育周期延长42.1%。关键发育节点统计显示，化蛹率骤降至3.7%（对照组90.7%），羽化率归零。时序分析发现，死亡率在注射后4天内集中爆发（日均死亡21%），死亡个体均伴随表皮蜕裂素分泌异常。

讨论

研究证实JH代谢稳态对昆虫变态发育具有决定性作用。JHAMT作为合成限速酶，其沉默导致JH_III滴度不足引发蜕皮启动障碍；而JHEH降解受阻则造成JH异常累积，干扰20-羟基蜕皮酮(20E)信号通路。相比传统饲喂法，注射递送有效克服了鳞翅目肠道核酸酶降解难题，但需优化纳米载体系统以实现田间应用。

结论

该研究首次系统阐明了JHAMT/JHEH双靶点调控海绵蛾发育的分子机制，2 μg dsRNA注射方案可使种群控制效率提升9倍。研究成果为开发环境友好型RNAi杀虫剂提供了理论支撑，对入侵物种综合治理具有重要实践意义。