猪源耐利奈唑胺和青霉素的希拉肠球菌中poxtA与pbp5fm基因共定位的遗传特征及传播风险研究

这篇研究首次报道了从猪粪便中分离的希拉肠球菌(Enterococcus hirae)HDC14-2同时携带poxtA（恶唑烷酮类耐药）和pbp5fm（β-内酰胺类耐药）基因的遗传特征。通过全基因组测序(WGS)和功能实验证实，这些耐药基因与13种其他耐药基因共同位于质粒pHDC14-2.133K的新型多重耐药(MDR)区域，该区域被IS1216元件包围并形成可转移单元(TUs)。电转化实验证明携带poxtA的质粒pHDC14-2.27K可在肠球菌间传播，且保持TU活性。研究揭示了动物源肠球菌作为耐药基因库对公共卫生的潜在威胁。

　　

耐药基因的"强强联合"：猪源肠球菌中新型耐药机制的发现

1. 引言
   临床"最后防线"抗生素正面临严峻挑战。利奈唑胺(linezolid)作为治疗耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的恶唑烷酮类关键药物，其耐药基因poxtA近年来在动物源菌株中被发现。与此同时，编码低亲和力青霉素结合蛋白的pbp5fm基因导致90%以上临床肠球菌对氨苄青霉素耐药。令人警惕的是，江苏某养猪场的粪便样本中首次分离出同时携带这两种耐药基因的希拉肠球菌(Enterococcus hirae)HDC14-2，其多重耐药(MDR)谱覆盖8类抗生素，包括苯丙醇类、四环素类、氨基糖苷类等。

2. 材料与方法
   研究团队采用Illumina HiSeq2000结合PacBio RS II测序技术完成全基因组测序(WGS)，通过ResFinder 3.1鉴定耐药基因。采用电转化法将质粒转入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)JH2-2，通过S1-PFGE和Southern杂交验证基因转移。特别设计12对引物检测IS1216介导的可转移单元(TUs)环化现象，并通过生长曲线和竞争实验评估适应性代价。

3. 结果
   3.1 耐药表型与基因型的完美对应
   菌株HDC14-2对氯霉素(32 mg/L)、利奈唑胺(8 mg/L)、四环素(64 mg/L)等均表现耐药，仅对环丙沙星和万古霉素敏感。WGS分析揭示其携带15个耐药基因，包括介导MLS_B耐药的erm(B)，介导氨基糖苷修饰的aac(6')-aph(2'')等，与表型高度吻合。

3.2 质粒"拼图"揭示基因流动路径
133 kb的pHDC14-2.133K质粒呈现嵌合结构：45.46 kb骨架区与E. hirae质粒pRZ1同源，而多重耐药(MDR)区则与E. faecium质粒pEf37BA相似。该区域包含两个IS1216-flanked的转座子：TU1(IS1216-poxtA)和TU2(IS1216-pbp5fm)。27 kb的pHDC14-2.27K质粒则携带可自主转移的IS1216-poxtA单元，与金黄色葡萄球菌AOUC-0915基因组片段高度同源。

3.3 电转化揭示"跳跃基因"的传播力
虽然接合转移未成功，但电转化实验证实pHDC14-2.27K可完整转入粪肠球菌JH2-2，使受体菌对利奈唑胺MIC从2 mg/L升至8 mg/L。Southern杂交显示poxtA以完整质粒形式转移，而非单独TU。值得注意的是，转化子未获得四环素耐药性，这与poxtA在某些遗传背景下的功能局限性相符。

3.4 IS1216介导的"基因快递"系统
反向PCR检测到两个环状中间体：4.2 kb的IS1216-poxtA和5.3 kb的IS1216-pbp5fm，证实这些TU可脱离母体质粒独立环化。这种"剪切-粘贴"机制使耐药基因能像"分子快递"般在不同遗传元件间跳跃。

3.5 适应性代价：耐药与生存的平衡术
生长曲线显示转化子与野生型无显著差异，但7天共培养竞争实验揭示3.7%的适应性劣势。质粒稳定性实验发现，无抗生素压力下30天后仍有89%的质粒保留率，说明虽然存在代谢负担，但选择压力下仍可稳定维持。

1. 讨论
   这项研究揭示了动物源肠球菌作为耐药基因"交换中心"的潜在风险。IS1216元件如同"分子剪刀"，通过形成TU促进poxtA和pbp5fm在菌种间传播。质粒嵌合现象表明不同肠球菌种间存在活跃的基因交流，而pbp5fm与poxtA的共定位可能产生"耐药协同效应"。尽管E. hirae致病性较弱，但其作为耐药基因"中转站"的潜力不容忽视。

2. 结论
   研究首次证实poxtA和pbp5fm在E. hirae中的共存现象，阐明IS1216介导的转座机制。发现于养猪场的这一案例，为兽医抗生素使用监管敲响警钟。未来研究应聚焦于TU整合的分子机制及其在自然菌群中的传播动力学。