淋巴样组织和CXCR4细胞靶向脂质纳米颗粒促进HIV-1前病毒DNA切除

本研究开发了CXCR4配体修饰的淋巴组织靶向脂质纳米颗粒（LNPs），用于递送CRISPR-Cas9/gRNA系统，实现了HIV-1潜伏感染CD4+ T细胞的高效靶向和前病毒DNA切除。通过整合阴离子脂质DOPS和CXCR4靶向肽CycPep，LNPs展现出脾脏选择性mRNA翻译和CXCR4受体介导的细胞摄取增强特性。在ART治疗的HIV-1感染人源化小鼠中，该技术实现了60%的病毒DNA切除效率，为功能性治愈提供了新策略。

　　

摘要

抗逆转录病毒疗法（ART）虽能控制HIV-1感染，但无法清除潜伏的前病毒DNA。研究团队设计了一种双功能脂质纳米颗粒（LNPs），通过整合阴离子脂质DOPS实现脾脏靶向，并利用CXCR4靶向肽CycPep（Cyclo(Nal-Gly-(D-Tyr)-Orn-Arg)）增强对感染细胞的递送效率。这种创新载体在淋巴组织和特定免疫细胞中展现出精准的CRISPR-Cas9系统递送能力。

1 引言

HIV-1潜伏库主要存在于淋巴组织和骨髓的CD4⁺ T细胞中。传统AAV载体存在免疫原性和递送限制，而LNPs凭借其可重复给药、高载量优势成为新选择。研究采用N¹-甲基假尿苷修饰的Cas9 mRNA（m1Ψ-mCas9）和2′OMe修饰的TatDE双gRNA（靶向gp41/tat/rev保守区），可覆盖50%以上HIV-1毒株。

2 结果与讨论

2.1 LNP合成与表征

通过微流控技术制备的靶向LNP（T-LNP）含5 mol% DOPS和0.2 mol% DSPE-PEG-CycPep，粒径85 nm（C-LNP为69 nm），pKa 6.37。冷冻电镜显示球形结构，mRNA包封率>97%，4℃下可稳定储存2个月。

2.2 脾脏靶向递送

在BALB/c和人源化小鼠中，T-LNP使脾脏/肝脏荧光信号比提升1.8倍。机制研究表明DOPS通过β2-糖蛋白I富集改变蛋白冠，而CycPep单独使用无靶向效果。

2.3 CXCR4介导的细胞摄取

在CXCR4高表达的JLat 8.4和J1.1细胞中，T-LNP的荧光素酶表达较U1细胞（低CXCR4）高3倍。使用CXCR4拮抗剂AMD070预处理后，T-LNP内吞效率下降60%，证实受体依赖性摄取。

2.4 基因编辑优化

gRNA/m1Ψ-mCas9摩尔比45:1时，在T细胞系中编辑效率最高。三次给药后，JLat 8.4细胞的HIV-1 DNA切除率达80%，而单次给药仅20%。

2.5 原代细胞验证

在HIV-1_NL4-3感染的淋巴母细胞中，T-LNP联合ART（DTG/FTC/TAF）实现90%前病毒清除，Sanger测序证实编辑位点精确性。

2.6 人源化小鼠实验

IPDA检测显示，T-LNP在脾脏和血液中切除效率达60%，显著高于C-LNP（5%）。肝脏因DNase活性高未能获得有效数据。

2.7 安全性评估

组织病理学显示主要器官无损伤，肝功能指标AST/ALT比值改善。三剂2 mg kg^-1剂量下未观察到体重变化或血液参数异常。

3 结论

该研究开创性地将组织靶向（DOPS）与细胞靶向（CycPep）策略整合于LNPs，克服了AAV载体的局限性。多剂量方案使编辑效率产生累积效应，为临床转化奠定基础。未来可拓展该平台至其他难治性疾病的基因治疗。