温度响应性刷状凝胶微载体(BrushGel)实现高效细胞扩增与低酶收获技术研究

本研究开发了基于明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝胶颗粒和聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)刷状聚合物共价接枝的温度响应性微载体(BrushGel)，通过微流控技术制备的单分散载体在动态培养中使人类真皮成纤维细胞(HNDF)密度提升4.9倍，间充质干细胞(MSCs)扩增5.3倍，低温(4°C)触发细胞收获效率达65%且活力>95%，仅需常规1/10酶用量即可实现规模化细胞生产。

　　

温度响应性刷状凝胶微载体的创新设计

通过3D打印微流控液滴发生器，研究团队开发了以GelMA水凝胶为核心、表面接枝PNIPAM聚合物刷的温度响应性微载体(BrushGel)。采用碳二亚胺化学(EDC-NHS)将羧基化PNIPAM(PNIPAM-COOH)共价固定在GelMA微球表面，通过调节GelMA甲基化程度(DOM)和PNIPAM浓度精确控制刷状聚合物密度。¹H-NMR和TNBS测定证实，低DOM组(GEL)保留了41%游离氨基，为PNIPAM接枝提供充足反应位点。扫描电镜显示接枝过程未改变微载体表面形貌，粒径分布检测证实制备的微载体单分散性优异(PDI<0.1)。

动态培养系统中的卓越性能

在自建搅拌式生物反应器中，优化配方BGLP5(低DOM GelMA+5mM PNIPAM)展现出显著优势：人类真皮成纤维细胞(HNDF)在30rpm转速下培养10天，细胞密度增加4.8倍，代谢活性较静态培养提高3倍。流式细胞术证实95%细胞保持CD90⁺/CD45^-表型，COL1A1基因表达上调12倍，前胶原蛋白分泌量提升8倍。值得注意的是，剪切力刺激显著促进细胞外基质分泌，120rpm条件下胶原产量达到静态培养的15倍。

突破性的低温收获机制

PNIPAM刷的构象变化在温度响应中起关键作用：37°C时疏水链段促进细胞粘附，4°C时亲水性转变引发体积膨胀。对于80%汇合度的HNDF细胞，60分钟低温处理可实现65%无酶收获，活力维持95%以上。临床级间充质干细胞(MSCs)培养中，0.025%胰蛋白酶联合低温处理使收获效率提升至69%，细胞活力达80%，较传统方法减少90%酶用量。热图分析揭示酶浓度与低温孵育时间存在协同效应，0.005%胰蛋白酶+120分钟组合即可实现68%细胞回收。

多细胞类型的适用性验证

研究涵盖三种细胞模型：肿瘤细胞(U251)、正常真皮成纤维细胞(HNDF)和骨髓来源MSCs。BGLP20配方使U251细胞附着率提升至80%，而MSCs在BGLP5上扩增5.3倍。细胞表型分析显示，动态培养的MSCs维持典型表面标志物表达(CD73⁺/CD90⁺/CD105⁺)，且经0.025%胰蛋白酶处理的细胞仍保持34%的T细胞增殖抑制能力，满足治疗性细胞功能要求。

规模化生产的转化潜力

该技术通过三大创新突破传统局限：微流控制备确保载体单分散性(310±33μm)；表面接枝策略将PNIPAM用量降低至总重量的0.5%；低温-低酶协同收获使操作成本降低10倍。在10mL规模生物反应器中，载体可稳定运行10天以上，为再生医学提供符合GMP要求的规模化细胞制造平台。未来通过机器学习优化载体参数组合，有望进一步拓展其在诱导多能干细胞(iPSCs)等敏感细胞类型中的应用。