鹌鹑细胞高密度灌流培养工艺生产溶瘤病毒rVSV-NDV的优化研究及其在癌症治疗中的应用潜力

这篇研究论文深入探讨了采用鹌鹑源CCX.E10细胞通过高密度灌流培养（HCD perfusion）生产重组水疱性口炎病毒-新城疫病毒（rVSV-NDV）的工艺优化。研究通过比较不同培养基（DYN与SCGM）的性能，发现SCGM在维持细胞特异性病毒产量（CSVY）方面更具优势。采用切向流深度过滤（TFDF）作为细胞截留装置（CRD），实现了20.6×106 cells/mL的高细胞密度培养，最终获得1.33×109 TCID50/mL的病毒滴度，空间时间产率（STY）较批次培养提高5倍。该研究为溶瘤病毒的大规模GMP生产提供了可行方案，显著提升了临床转化潜力。

　　

ABSTRACT

溶瘤病毒在癌症治疗领域展现出巨大潜力，其中重组水疱性口炎病毒-新城疫病毒（rVSV-NDV）因其独特的融合蛋白介导的合胞体形成能力和免疫刺激特性备受关注。本研究聚焦于优化GMP合规的鹌鹑源CCX.E10细胞生产rVSV-NDV的灌流工艺，旨在解决临床剂量需求（单剂高达10¹¹病毒颗粒）的生产瓶颈。

1 Introduction

溶瘤病毒通过直接裂解肿瘤细胞和激活免疫反应的双重机制发挥作用。rVSV-NDV作为VSV骨架搭载NDV糖蛋白的嵌合病毒，其突变融合蛋白可被宿主蛋白酶切割，显著增强病毒扩散效率。前期研究虽在BHK-21细胞中实现7.5×10⁹ TCID₅₀/mL的滴度，但CCX.E10细胞因其安全性、无合胞体形成特性成为更优候选。

2 Materials and Methods

实验采用两种培养基：基础培养基SCGM（含生长因子补充）和商业化Dynamis AGT（DYN）。通过半灌流摇瓶实验评估细胞生长极限，发现DYN支持细胞密度达7.5×10⁷ cells/mL，但SCGM的CSVY高出2.5-5倍。3L生物反应器整合TFDF系统（2-5 μm孔径）实现99.9%细胞截留，灌注率根据细胞比灌注速率（CSPR）动态调节。

关键发现包括：

• 培养基优化：SCGM在病毒生产阶段表现优异，混合培养基策略未能显著提升滴度

• 灌流工艺优势：TFDF系统在20×10⁶ cells/mL时保持低压（<0.12 psi），渗透液浊度降低33倍

• 生产指标：最终获得1.33×10⁹ TCID₅₀/mL滴度，STY达3.69×10¹¹ TCID₅₀/d

3 Results

3.1 半灌流模式对比

SCGM组CSVY达98 TCID₅₀/cell，但细胞密度上限（1.5×10⁷ cells/mL）低于DYN组（7.5×10⁷ cells/mL）。值得注意的是，高密度培养导致CSVY降低45%，呈现典型"细胞密度效应"。

3.3 灌流生物反应器验证

TFDF系统实现连续收获，病毒回收率>99%。渗透液与反应器内滴度差异小于检测误差，证实膜系统无产物滞留。按5×10¹⁰ TCID₅₀/剂计算，单批次可生产55个临床剂量。

4 Discussion

研究揭示了培养基成分对病毒生产的复杂影响：DYN虽支持细胞增殖，但SCGM特有的生长因子（如腐胺）对维持病毒复制至关重要。TFDF技术首次应用于CCX.E10细胞，其低剪切力特性特别适合无合胞体形成的禽类细胞。尽管当前工艺的VVP（3.7×10¹⁰ TCID₅₀/(L×d)）较批次培养降低1.9倍，但STY的提升使得该技术具备工业化放大潜力——理论上2000L规模可年产百万级临床剂量。

这项研究为溶瘤病毒的大规模生产提供了关键技术路线，其创新点在于：

1. 首次建立CCX.E10细胞的灌流培养体系

2. 验证TFDF在禽类细胞病毒生产中的适用性

3. 明确培养基选择需平衡细胞生长与病毒产率

   未来工作可聚焦于灌注速率优化以缓解细胞密度效应，以及整合下游纯化工艺实现端到端GMP生产。