氢化酶介导的铜纳米颗粒生物合成：一种新型绿色催化材料的制备机制与应用前景

这篇研究揭示了Shewanella oneidensis MR-1通过[NiFe]氢化酶HyaB介导的H2氧化途径，将Cu(II)完全还原为具有催化活性的Cu(0)/Cu(I)纳米颗粒（CuNPs）的分子机制。该工作首次证实氢化酶在铜生物还原中的核心作用，突破了传统c型细胞色素（OMCs）路径的限制，为工业废水铜回收和纳米催化剂绿色合成提供了新策略。合成的CuNPs在点击化学反应中表现优异，缺陷结构（如堆垛层错和纳米孪晶）进一步增强了催化性能。

　　

氢化酶介导的铜纳米颗粒生物合成机制

Abstract

Shewanella oneidensis MR-1被发现能通过生物还原Cu(II)_(aq)合成具有优异点击化学催化活性的细胞负载铜纳米颗粒（CuNPs）。然而，其酶学机制长期未明。本研究首次揭示：氢气氧化作为电子供体对Cu(II)生物还原至关重要，并通过基因敲除实验证明周质[NiFe]氢化酶HyaB的关键作用。野生型（WT）细胞能将H₂氧化与周质内Cu(0)/Cu(I)-NPs的合成偶联（通过XRD、TEM-SAED、EDS、EELS证实），而ΔhyaB突变体则完全丧失该能力。生物合成的CuNPs能高效催化甲基叠氮乙酸酯与1-己炔的环加成反应，证实了微生物将含铜废水转化为功能性纳米材料的潜力。

1 Introduction

作为模式金属还原菌，S. oneidensis MR-1能还原Cr(VI)、Tc(VII)、Pd(II)等多种金属。铜作为绿色能源转型的关键元素，其需求激增促使开发从非常规资源（如采矿废水、电子垃圾）中回收铜的生物技术。传统认为c型细胞色素（如Mtr通路）介导金属还原，但前期研究发现其对Cu(II)还原不完全。有趣的是，氢化酶在Pd(II)、Au(III)、Tc(VII)还原中发挥作用，但铜还原领域尚未探索。本研究聚焦氢化酶在Cu(II)还原中的作用及其与c型细胞色素的互作。

2 Results and Discussion

2.1 CuNP Synthesis with H₂ as Electron Donor

在H₂作为唯一电子供体时，24小时后反应体系由无色变为粉红色（Cu(II)还原特征），并去除98%溶解铜。而乳酸作为电子供体时仅去除26.9% Cu(II)，且未观察到颜色变化。无电子供体对照组显示48.9%铜去除（推测为生物吸附）。

2.2 Cu(II) Bioreduction Mechanisms

通过氢化酶敲除菌株实验发现：ΔhyaB（缺失[NiFe]氢化酶）和ΔhydA/ΔhyaB（双敲除）完全丧失CuNP合成能力，而ΔhydA（缺失[FeFe]氢化酶）仍保留73%铜去除率，表明HyaB是Cu(II)完全还原的关键酶。这与该菌还原Tc(VII)、Pd(II)的机制一致，但突破了"铜抑制氢化酶"的传统认知。

2.3 Hydrogen Metabolism and Cu(II) Bioreduction

丙酮酸发酵实验显示，WT细胞在2小时内生成226.8 μM H₂（ΔhyaB无生成），加入Cu(II)后H₂被完全消耗并伴随CuNPs形成。这表明预先丙酮酸孵育可通过内源H₂生成优化金属还原效率，这一现象与前期Pd(II)研究中观察到的氢化酶和Mtr通路基因上调相符。

2.4 Cu(II) Interactions with Outer Membrane Cytochromes

无代谢活性体系中，浴铜灵实验证实细胞通过非代谢途径将部分Cu(II)还原为Cu(I)。体外实验显示纯化的MtrC（还原态）可在3分钟内被Cu(II)重新氧化，但全细胞中c型细胞色素无法完成Cu(II)→Cu(0)的完全还原。更值得注意的是，Cu(II)预处理会完全抑制细胞后续对Pd(II)的还原能力，这对混合金属废水处理提出新挑战。

2.5 Characterization of Mixed Cu(I)/Cu(0) Nanoparticles

XRD显示仅H₂孵育的WT样品存在Cu(0){111}晶面（43.3°）和Cu₂O{200}/{220}晶面特征峰。Scherrer分析显示12-27 nm的纳米晶，其中<20 nm颗粒主要为Cu₂O，>20 nm为Cu(0)。TEM显示粒径双峰分布（10 nm和25-100 nm），高分辨图像显示堆垛层错和纳米孪晶等缺陷结构。薄切片STEM证实CuNPs主要位于周质（与HyaB定位一致），EELS-MLLS拟合证实颗粒为Cu(0)核-Cu(I)壳结构。

2.6 Biotechnological Application

在模型点击反应中，生物CuNPs（3-6 mol%载量）可完全催化甲基叠氮乙酸酯与1-己炔的环加成，与化学合成Cu催化剂效率相当，验证了其实际应用价值。

3 Conclusion

本研究首次阐明[NiFe]氢化酶HyaB介导的Cu(II)生物还原机制，突破了OMCs路径的限制。CuNPs的周质定位、核壳结构及晶体缺陷使其成为理想的绿色催化剂。未来可通过优化氢化酶活性（如丙酮酸预孵育）和工程菌改造，推动含铜废水资源化技术的工业化应用。

3.1 Outlook

氢化酶家族（尤其是HyaB）在Tc(VII)、Pd(II)、Au(III)等金属还原中的普适性逐渐显现，但其活性受环境因素（pH、配体等）调控的机制仍需探索。同时，铜对OMCs电子传递的抑制效应警示：混合金属废水处理需考虑金属间相互作用。通过合成生物学手段（如串联表达酶与纳米催化剂）可能开创生物催化新范式。