利用高效二维液相色谱-串联质谱（2D-LC-MS/MS）技术鉴定寡核苷酸药物杂质

《Analytica Chimica Acta》：Identification of Oligonucleotide Drug Impurities Using Heart-Cutting Two-Dimensional Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (2D-LC-MS/MS)

oligonucleotide药物杂质分析采用新型heart-cutting 2D-LC-MS/MS方法，结合AEX与RIPC色谱分离，通过MS确定分子量，DDA-MS/MS解析序列，成功检测Givosiran和Patisiran中3和20种杂质，解决传统方法定量困难问题。

　　近年来，随着基因治疗技术的不断发展，寡核苷酸类药物因其能够精准调控基因表达的能力，逐渐成为制药领域的重要研究方向。这类药物通常由短链核苷酸组成，长度约为20个单位，通过抑制、添加、替换或编辑基因，实现对疾病的长期治疗效果。然而，寡核苷酸药物在制备、纯化及储存过程中容易产生多种杂质，这些杂质不仅可能影响药物的稳定性，还可能对药物的安全性、疗效和整体质量产生不利影响。因此，对这些杂质的识别和深入分析成为确保药物质量的关键环节。

传统杂质检测方法在面对一些细微的杂质，如氧化产物和水解产物时，往往存在一定的局限性。这类杂质的结构变化通常较小，难以通过常规手段有效分离和鉴定。为了克服这些挑战，研究人员不断探索更先进、更可靠的分析技术，以提高杂质检测的灵敏度和准确性。在这一背景下，一种结合心切二维液相色谱（Heart-Cutting 2D-LC）与串联质谱（MS/MS）的新型分析方法被提出，该方法在寡核苷酸药物杂质分析中展现出显著的优势。

心切二维液相色谱是一种高效分离复杂混合物的技术，它通过将第一维分离后的部分组分（即“心切”部分）转移到第二维进行进一步分离，从而提高整体的分辨率和分析效率。这种方法能够显著缩短分析时间，同时增强样品处理的效率。在本研究中，第一维采用阴离子交换色谱（AEX）对寡核苷酸片段（15-45个碱基）进行快速分离，优化了缓冲液和非挥发性盐系统的使用条件，以确保分离过程的稳定性和高效性。第二维则采用反向离子对色谱（RIPC），这种色谱技术利用挥发性离子对试剂，使得样品能够更好地兼容质谱分析。通过这种组合，研究团队成功实现了对寡核苷酸药物中多种杂质的高效分离与准确鉴定。

在实际应用中，该方法被用于分析两种基于RNA干扰（RNAi）的药物：Givosiran和Patisiran。前者用于治疗急性肝卟啉症，后者则用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性病。通过该技术，研究人员成功鉴定了Givosiran中的3种杂质，以及Patisiran中的20种杂质，涵盖了氧化产物、水解产物等关键杂质类型。此外，结合数据依赖性采集（DDA-MS/MS）技术，该方法还能够对杂质的分子量和结构特征进行详细分析，从而提供全面的杂质谱信息。

这种新型的二维液相色谱-质谱联用技术不仅提高了杂质检测的效率，还增强了对复杂杂质的识别能力。在传统的分析方法中，虽然RIPC-MS和RIPC×HILIC-MS等技术已经被广泛应用，但它们在检测氧化产物和尾部脱水产物等低浓度、结构差异细微的杂质时仍存在一定的困难。而本研究提出的心切二维液相色谱-串联质谱方法，通过优化第一维和第二维的分离条件，实现了对这些杂质的精准检测，为寡核苷酸药物的质量控制提供了新的思路和技术支持。

从实际应用的角度来看，该方法的推广将有助于制药企业更好地理解和控制寡核苷酸药物的杂质组成，从而提高药物的安全性和有效性。对于那些需要长期使用或具有高度靶向性的寡核苷酸药物，杂质的积累可能会对疗效产生严重影响，甚至引发不良反应。因此，建立一种高效、准确、稳定的杂质分析方法，不仅有助于药物研发阶段的优化，还能在药物上市后提供持续的质量监控支持。

此外，该方法还具备良好的可扩展性，可以适用于不同类型的寡核苷酸药物，包括但不限于RNAi药物、反义寡核苷酸（ASO）药物以及小干扰RNA（siRNA）药物等。这为未来更多寡核苷酸药物的杂质分析提供了技术基础，有助于推动整个领域的技术进步和药物开发。

在实际操作过程中，研究人员需要综合考虑多种因素，包括缓冲液的选择、离子对试剂的使用、色谱柱的类型以及质谱的参数设置等。例如，在第一维AEX中，缓冲液的pH值和离子强度对分离效果具有重要影响，而第二维RIPC中，离子对试剂的种类和浓度则决定了样品的分离能力和质谱分析的兼容性。通过系统性的优化实验，研究团队确定了最适合该分析方法的条件组合，从而实现了对杂质的高效分离和准确识别。

值得注意的是，该方法在实际应用中还需要考虑样品的稳定性问题。由于某些分离步骤可能涉及高有机溶剂含量，这可能会对样品的结构和完整性造成影响。因此，研究团队在实验设计中特别关注了样品处理过程中的稳定性，采取了一系列措施来确保在高有机溶剂环境下，杂质的结构不会发生显著变化，从而保证检测结果的可靠性。

通过对Givosiran和Patisiran的杂质分析，该方法不仅展示了其在实际药物分析中的有效性，还揭示了寡核苷酸药物中存在多种复杂的杂质类型。这些杂质可能来源于药物合成过程中的副反应、纯化过程中的不完全去除，或是储存过程中发生的化学降解。其中，氧化产物和水解产物因其对药物稳定性的影响较大，成为研究的重点。通过该方法，研究人员能够更全面地了解这些杂质的存在情况及其对药物性能的影响，为后续的药物优化和质量控制提供了重要依据。

总的来说，这项研究提出了一种创新的分析方法，将心切二维液相色谱与串联质谱相结合，有效解决了传统方法在杂质检测中的不足。该方法不仅提高了检测的灵敏度和准确性，还显著缩短了分析时间，增强了样品处理的效率。这对于推动寡核苷酸药物的开发和应用具有重要意义，同时也为制药行业提供了更为可靠的杂质分析工具，有助于提升药物的安全性、稳定性和治疗效果。未来，随着该方法的不断完善和推广，相信它将在寡核苷酸药物的质量控制和研发过程中发挥更大的作用。