关于使用在线二维SEC-UV-RPLC-MS方法对基因治疗产品进行多属性表征的概念验证研究

《Analytica Chimica Acta》：A proof of concept study on the use of online two-dimensional SEC-UV-RPLC-MS method for the multi-attribute characterization of gene therapy products

本研究开发了一种二维液相色谱-质谱联用技术（SEC-UV-RPLC-MS），用于同时评估重组腺相关病毒（rAAV）的聚合体含量、病毒蛋白（VP1/VP2/VP3）组成及其翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化）。该方法通过SEC分离聚合体与单体，RPLC-MS在线分析VPs及其修饰，成功应用于rAAV8、rAAV2和rAAV9的检测，并验证了其在温度应力下的稳定性评估能力，为基因治疗产品的高效多属性分析提供了新工具。

　　在现代生物医学领域，基因治疗已成为治疗遗传病和其他严重疾病的重要手段。其中，重组腺相关病毒（rAAV）载体因其独特的生物学特性，成为基因治疗产品中最受欢迎的递送平台之一。目前，已有七种rAAV基因治疗产品获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，同时全球正在进行超过350项相关的临床试验。这表明rAAV在基因治疗领域的应用前景广阔。然而，由于rAAV结构的复杂性和异质性，对这类产品的质量控制变得尤为重要。为了确保其安全性和有效性，必须对关键质量属性（CQAs）进行全面监控，包括聚集现象、完整/空壳比例、病毒蛋白组成以及后翻译修饰（PTMs）等。虽然已有多种色谱技术用于分析这些CQAs，但行业对于能够在单次分析中同时评估多个属性的方法需求日益增长。

本研究中，我们开发了一种结合尺寸排阻色谱（SEC）-紫外检测（UV）-反相液相色谱（RPLC）-质谱（MS）的多维色谱分析方法，即SEC-UV-RPLC-MS。这种方法能够在不到20分钟的分析时间内，对rAAV载体进行综合表征，包括高分子量物种（HMWS）的比例、病毒衣壳的组成以及后翻译修饰的检测。在第一维，SEC用于分离完整的病毒颗粒并半定量分析聚集物的比例，为产品的纯度和聚集程度提供信息。随后，通过心切技术收集单体成分，并将其注入第二维RPLC-MS中进行蛋白分离和鉴定。该方法最初优化用于rAAV8，但经过验证后，成功扩展至其他rAAV血清型，如rAAV2和rAAV9，显示出其在不同血清型中的适用性。此外，还进行了热应力下的强制降解研究，以评估该方法在监测病毒载体结构稳定性和热稳定性方面的有效性。

rAAV作为非包膜病毒，来源于Parvoviridae家族Dependovirus属，其衣壳呈现二十面体对称结构，并由VP1、VP2和VP3三种病毒蛋白组成，比例为1:1:10。这些蛋白的分子量范围大约在50至85千道尔顿之间，共同决定了rAAV的血清型特异性表面特征和组织嗜性。在衣壳内部，包含了一段约4.7千碱基对的单链DNA（ssDNA）基因组，两端具有145个碱基对的倒置重复序列，这些序列在病毒复制和包装过程中起到重要作用。与野生型AAV不同，rAAV通过去除复制和衣壳形成所需的rep和cap基因，仅保留治疗基因的表达，从而成为一种无复制能力且安全的治疗载体。

rAAV基因治疗产品通常通过体内的途径给予患者，如静脉注射或眼内注射，以确保病毒载体能够有效传递治疗基因至目标细胞的细胞核，进而实现其治疗作用。然而，由于rAAV的复杂结构和大分子量，其表征相比小分子药物更具挑战性。因此，行业对能够同时评估多个CQAs的高效分析方法需求迫切。多维液相色谱（2D-LC）技术因其能够在一个分析流程中完成多种检测，受到了广泛关注。在本研究中，我们利用SEC-UV-RPLC-MS方法，不仅能够有效评估rAAV的聚集情况，还能够同时分析病毒衣壳的组成及其后翻译修饰，为rAAV的全面质量评估提供了新的工具。

在方法开发过程中，我们首先对SEC条件进行了优化。采用Sepax SRT SEC-500柱，结合特定的缓冲液配方（200 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.2 ± 0.1，250 mM KCl），能够有效分离rAAV的高分子量物种与单体。该缓冲液的组成选择基于实验观察，发现pH的变化对所有血清型的HMWS分离和定量没有显著影响。此外，较高的KCl浓度有助于防止非特异性离子相互作用导致的样品吸附，从而确保分离效果。通过实验发现，样品浓度对聚集水平有显著影响，高浓度样品更容易形成聚集，因此建议在分析前不进行稀释。

在第二维RPLC-MS分析中，我们采用了特定的条件以确保病毒衣壳的有效变性。使用DFA作为流动相添加剂，不仅能够提高蛋白分离的分辨率，还能增强质谱检测的灵敏度。此外，选择合适的色谱柱（如ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱）和梯度条件，对于有效分离和鉴定rAAV的三种蛋白至关重要。通过调整柱温，我们发现将柱温从80°C降低至60°C可以显著减少VP3的水解现象，从而确保分析结果的真实性。这种优化策略不仅提高了方法的稳定性，还减少了不必要的修饰产物，使分析结果更贴近样品的真实组成。

在实际应用中，SEC-UV-RPLC-MS方法不仅适用于rAAV8，还成功应用于rAAV2和rAAV9等其他血清型。通过心切技术收集单体成分，并结合RPLC-MS分析，能够实现对不同血清型rAAV的综合表征。实验结果显示，不同血清型的rAAV在SEC条件下的单体保留时间相近，因此可以使用统一的心切时间进行分析。然而，对于某些血清型（如rAAV2），在RPLC分离过程中仍存在VP1和VP2共洗脱的问题，这提示可能需要对RPLC条件进行进一步优化以提高分辨率。

为了验证该方法在强制降解研究中的应用效果，我们对rAAV9样品在不同温度下进行了长达48小时的热应力实验。结果显示，在5°C储存的样品保持稳定，而25°C和40°C储存的样品则出现了不同程度的聚集现象。特别是在40°C条件下，样品中高分子量物种的比例显著增加，表明高温可能对rAAV的结构稳定性产生不利影响。此外，在第二维RPLC-MS分析中，我们观察到VP3的去酰胺化形式比例增加，这进一步表明该方法能够有效检测rAAV在不同环境下的稳定性变化。

通过本研究，我们开发了一种高效的多维色谱分析方法，为rAAV基因治疗产品的全面质量评估提供了重要支持。该方法不仅能够在短时间内完成多个CQAs的分析，还具有良好的适应性和可扩展性，适用于多种血清型的rAAV。此外，通过优化分离条件和检测流程，我们成功减少了不必要的蛋白修饰和聚集现象，确保了分析结果的准确性和可靠性。这种方法在实际应用中具有广泛的潜力，可用于实时生产过程控制、产品稳定性评估、工艺开发支持以及治疗药物的鉴定。未来，随着该方法的进一步验证和标准化，有望在基因治疗产品的质量控制体系中发挥重要作用，为提高治疗效果和安全性提供科学依据。