工程化细胞色素P450 BM3催化佛手柑素环氧衍生物的绿色合成及其生物活性研究

本研究针对天然产物结构修饰的化学合成污染问题，开发了基于工程化细胞色素P450 BM3（D251G/Q307H突变体）的生物催化体系。研究人员通过分子对接筛选和比色法高通量筛选，首次实现细菌P450对佛手柑素的高效环氧化（1小时转化率87%），获得2′,3′-、6′,7′-单环氧及双环氧三种新型衍生物。其中双环氧衍生物展现出显著抗菌活性（抑制E. coli生长），2′,3′-环氧衍生物促进成纤维细胞增殖，为天然产物绿色改性及药物开发提供新策略。

　　

在天然产物药物开发领域，化学合成面临环境污染和步骤繁琐的困境，而植物源活性成分如佛手柑素（bergamottin）虽具有抗菌、抗氧化等潜力，却存在生物利用度低、天然含量稀少等问题。传统化学环氧化需使用mCPBA等强氧化剂，成本高达3万欧元/克，且难以实现选择性修饰。针对这一挑战，来自意大利都灵大学（University of Torino）的研究团队在《Bioorganic Chemistry》发表创新成果，通过蛋白质工程改造的细胞色素P450 BM3突变体，实现了佛手柑素的绿色生物催化转化。

研究团队采用分子对接预筛7种天然产物，建立基于苯乙烯氧化的比色高通量筛选法，结合HPLC-MS/MS分析验证代谢产物。通过全细胞催化体系优化，使用E. coli表达P450 BM3 A2突变体（D251G/Q307H），实现了90%的底物转化率。生物活性测试采用MTT法检测L929细胞活力，微稀释法评估抗菌活性。

分子对接与比色筛选发现，佛手柑素能以5.72 kcal/mol结合能进入P450 BM3 A2活性中心。突变体催化效率较野生型提升3倍，1小时内将150μM佛手柑素转化为2′,3′-环氧（15.2μM）、6′,7′-环氧（22.0μM）和2′,3′-6′,7′-双环氧（106.3μM）三种产物，其中6′,7′-环氧的k_cat达17.8 min^-1。

全细胞催化显示，菌体裂解液可实现与纯酶相当的转化效率。双环氧衍生物对E. coli DH5α生长抑制率达60%（50μM），而2′,3′-环氧衍生物使L929细胞活力提升20%，呈现显著构效关系。该突变体通过I-螺旋区D251G突变破坏盐桥，增大底物通道灵活性，使Phe87预旋转90°，从而适应大体积底物。

该研究首次报道细菌P450催化佛手柑素环氧化，建立的比色筛选法为天然产物修饰提供通用平台。双环氧衍生物的新型抗菌活性及2′,3′-环氧衍生物的促细胞增殖作用，为开发柑橘加工副产物高值化利用途径奠定基础。工程化P450 BM3在保留区域选择性的同时突破底物限制，为绿色制药提供新工具。研究成果对解决药物研发中"葡萄柚汁效应"（抑制P450 3A4）等难题具有重要启示。