综述：动态蛋白质体系的多色单分子荧光共振能量转移研究

这篇综述系统阐述了多色单分子FRET（smFRET）技术在蛋白质构象、相互作用及动力学研究中的最新进展，重点介绍了三色/四色FRET的标记策略、数据分析方法及其在蛋白质折叠和基因调控中的应用，为复杂生物分子过程的动态解析提供了多维视角。

　　

多色单分子FRET技术解析动态蛋白质系统

引言

F?rster共振能量转移（FRET）通过供体（D）与受体（A）间的非辐射能量转移，可精确测量2-12 nm范围内的距离变化。单分子FRET（smFRET）突破了传统技术的局限，能解析异质性样本中的构象状态。多色FRET通过引入三色或四色荧光标记（如D₁-A₁(D₂)-A₂系统），实现了多维度协同运动的实时观测，但数据校正复杂度显著增加。

三色FRET的能量转移机制

三色FRET中，能量转移路径包括D₁→A₁(D₂)、D₁→A₂和A₁(D₂)→A₂，需通过邻近比（PR）和表观FRET效率（E_DA1、E_DA2）量化。校正因子如光谱串扰（ct）、直接激发（de）和检测效率差异（γ）需纳入分析，公式推导显示：

PR_DA1 = I_A1(D2)^Dex / (I_D1^Dex + I_A1(D2)^Dex + I_A2^Dex)

绝对FRET效率需进一步通过3C-PDA（三色光子分布分析）等统计方法优化。

技术进展

1. 溶液体系：结合交替激光激发（ALEX）或脉冲交错激发（PIE），可解析微秒至毫秒级动力学。

2. 表面固定：全内反射荧光（TIRF）显微镜结合深度学习工具（如Deep-LASI）实现了三色数据的自动分类与动力学参数提取。

3. 标记策略：非经典氨基酸（ncAA）与点击化学联用（如CuAAC反应）实现了蛋白质特定位点的三色标记，如代谢型谷氨酸受体mGlu₂的活细胞标记。

应用案例

• 分子伴侣研究：Hsp90通过三色FRET揭示其二聚体旋转平移运动；Hsp70同源物（DnaK、BiP）的SBD-NBD构象耦合与底物结合动态通过三色FRET可视化。

• 蛋白质折叠：α₃D蛋白的折叠路径通过三色标记（Alexa488-UA、Cys33-Alexa594、C端-CF680R）实时追踪；麦芽糖结合蛋白（MBP）的折叠研究表明N端结构域（NTD）优先折叠驱动C端结构域（CTD）成熟。

• 基因调控：组蛋白H2A-H2B二聚体交换通过三色FRET（Cy3-Cy5/Cy5.5）证实其自发性和Nap1依赖性；核糖体亚基组装中，真核起始因子（eIF5B）的时序作用通过四色ZMW观测解析。

展望

多色FRET与微流控、荧光寿命成像等技术的融合，将进一步推动其在动态组装体研究中的应用，为结构生物学提供更高时空分辨率的工具。