利用软电离化学反应与在线采样接口相结合的方法，实现对茶叶挥发物的实时监测

《Green Analytical Chemistry》：Real-time monitoring of tea volatiles using soft ionization by chemical reaction in transfer with an online sampling interface

茶 volatile 物质在线监测系统开发及分析. 开发了集成 SICRIT 离子源和质谱的在线监测系统，实时追踪茶样烘烤（160°C）过程中挥发物的动态释放，无需预处理即可区分不同发酵程度的茶类（绿/黄/白/乌龙/黑/普洱）及其化学指纹（N-杂环化合物、酯类等 200+ 种物质），通过多变量分析验证其高效性与便携性优势。

　　茶的挥发性物质分析对于评估茶叶品质、评价其风味以及控制生产工艺具有重要意义。在本研究中，研究人员开发了一种在线监测系统，该系统直接与一种名为SICRIT（通过化学反应实现软电离）的离子源耦合。这种系统能够实现对茶叶的在线烘烤，并将生成的蒸汽实时转移至SICRIT离子源进行电离和高分辨率质谱检测。研究结果表明，在烘烤过程中，茶叶中会逐步释放出多种挥发性化合物。不同时间段内观察到的质谱特征差异显著，且不同发酵程度的茶叶表现出不同的化学指纹。所检测到的化合物包括氮杂环化合物、酯类、胺类、醇类、氨基酸等。其中一些是具有特色的茶香成分，而另一些则是美拉德反应产物。通过多元数据分析，研究人员能够基于获取的质谱数据明确区分不同茶叶样品。SICRIT系统以其微型化设计和简便操作，展现出卓越的性能，能够直接分析气味化合物。集成的SICRIT-MS系统通过连续的蒸汽生成、转移和电离，实现了对挥发性化合物的直接、实时分析，提供了一种无需样品预处理或前端分离的简单高效分析方法。

茶叶作为一种广受欢迎的饮品，因其多样的风味和潜在的健康益处而备受关注。茶叶的风味是决定其品质和感官特性的重要因素，受到茶树品种、生产环境、发酵程度以及冲泡方法等多重因素的影响。茶叶的独特风味源于其复杂的化学组成，如茶多酚、氨基酸、咖啡因和挥发性芳香化合物等。对这些挥发性化合物的识别和表征对于茶叶质量评估、风味分析以及工业生产控制至关重要。

传统的茶叶挥发性化合物分析通常涉及离线样品预处理，随后使用不同的分析技术进行检测。首先，茶叶活性成分通常通过不同溶剂和方法提取，以获得液体提取物。固相微萃取（SPME）是一种常用的提取和富集分析物的方法，可以采用头空萃取或直接浸入茶汤的方式进行。在色谱技术中，液相色谱（LC）和气相色谱（GC）结合质谱（MS）目前是茶叶风味分析中最广泛使用的平台。由于大多数风味化合物具有挥发性，GC-MS技术尤为常见，并且SPME可以直接与GC-MS结合，通过热脱附、分离和检测分析物。尽管GC-MS和LC-MS能够提供可重复的结果，并且在不同茶叶中识别出多种芳香成分，但这些方法仍然存在诸多局限性，例如对样品状态有较高的要求、方法开发繁琐以及分析过程耗时。此外，基于液相的分析方法需要消耗大量有机溶剂，而基于气相的分析方法则依赖于大量的气体供应。

近年来，分析技术的进步促使传统方法——通常以高能耗、实验室依赖和环境问题为特点——向便携式、低碳和现场分析方向转变。环境离子化质谱（AIMS）能够实现对样品在原生状态下的直接、实时分析，且无需或仅需少量样品预处理。例如，脱附电喷雾（DESI）、实时直接分析（DART）和大气压化学电离（APCI）等技术，能够减少复杂的样品预处理步骤，简化工作流程，提高高通量分析的效率。这些技术通常不需要溶剂、气体或试剂，从而降低了分析的复杂性和成本。然而，对于茶叶分析而言，大多数环境离子化技术主要应用于茶汤和液体提取物，只有少数研究直接分析未经处理的茶叶样品，通过将茶叶直接放置在离子源前进行挥发性物质的释放。此外，一些环境离子源在设计的简单性、便携性以及符合绿色化学原则的能效方面仍面临挑战。例如，APCI需要化学试剂，DART依赖于高纯度气体，而DESI则需要高压和溶剂供应。

SICRIT是一种基于介质阻挡放电离子化（DBDI）原理的活性毛细管等离子体源。它可以直接安装在质谱仪的大气压入口，并且在电离过程中不需要溶剂、气体或试剂。离子化机制通过等离子体驱动的反应实现，分析物在通过离子源时被空气、氮气（干燥或湿润）或其他掺杂气体携带。这种离子源具有紧凑的设计和轻巧的重量（包括控制器在内仅重2.4千克），非常适合移动应用，同时能有效减少外部污染。已有研究证明，SICRIT在不同应用中对气味分析具有显著效果，包括食品和咖啡风味分析、汽车尾气监测、临床呼吸分析以及化学战剂检测。然而，SICRIT在茶叶样品分析中的应用仍处于探索阶段。SICRIT离子源能够直接电离气态和挥发性样品，因此其样品引入系统和接口尤为重要。目前主要的样品引入方式包括：将样品放置在离子源前，使其自然挥发进行直接嗅探，以及通过加热装置进行热脱附，将挥发性成分输送至离子源。然而，这些研究并未系统地探讨挥发性物质随时间的变化。

本研究的目标是开发一种与SICRIT离子源耦合的在线采样接口，用于茶叶烘烤和挥发性物质传输分析。该系统使茶叶挥发性物质逐步进入离子源，实现实时电离和高分辨率质谱检测。这种创新方法能够动态监测茶叶烘烤过程中挥发性化合物的变化，而无需样品预处理，从而提高了分析效率，降低了操作成本，并支持可持续的工业实践。

在实验部分，研究人员分析了不同发酵程度的茶叶样品，包括绿茶（黄山毛峰）、黄茶（霍山黄大茶）、白茶（贡眉白茶）、乌龙茶（武夷岩茶）、红茶（金骏眉）和黑茶（普洱茶）。这些茶叶样品的详细信息列在补充信息（SI）中的表S1中。所有样品在分析前均储存在4°C的冰箱中，并在室温下平衡12小时。实验中使用了高效液相色谱（HPLC）级甲醇（来自Merck GmbH & Co. KG，德国达姆施塔特），以及由娃哈哈集团（中国杭州）提供的纯净水。99.9%纯度的氮气来自南京万达特种气体公司（中国南京）。

研究人员定制了一个带有温度控制系统的加热线圈（内径30 mm × 高度80 mm），该线圈从苏州亿丰电热厂获得。不锈钢升降台从河北广合实验室耗材厂购买。20 mL的石英瓶来自Beekman公司（中国湖南），LZB-3WB玻璃转子流量计来自泰州流量计实验室仪器公司。不锈钢管（外径4 mm，内径3.5 mm）从泰州宣航金属公司购得，硅胶管用于气体传输，来自上海道观旗舰店。

在线监测系统的设计如图1A和1B所示。在该设置中，未经处理的茶叶样品被放置在带有加热线圈的石英瓶中，用于温度控制。瓶盖被改装，增加了两个钻孔，以容纳不锈钢管（SST）：一根连接至氮气供应，用于载气；另一根则通过螺纹连接至SICRIT离子源入口。不锈钢升降台用于优化采样阀的位置。在加热条件下，挥发性蒸汽持续从茶叶样品中生成，氮气的流动有助于将茶叶蒸汽高效地传输至离子源。通过开发的SICRIT接口，蒸汽化的分析物流经中间路径，在离子源中经历等离子体反应生成分子离子，随后被仪器的真空压力吸入质谱系统。

在SICRIT-MS分析中，SICRIT离子源与高分辨率四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱仪（Agilent 6530，美国加利福尼亚）耦合。SICRIT离子源在1700 V的采集电压下运行，频率为15,000 Hz。质谱数据在正离子模式下采集，质量范围覆盖m/z 50-500。Q-TOF参数包括0.02 μA的毛细管电流、3.0 L/min的干燥气体流速和300°C的气体温度。每种茶叶样品类型被分析六次，以确保数据的可重复性和稳定性。

在数据处理方面，原始质谱数据使用MassHunter 10.0软件（Agilent，美国加利福尼亚）进行处理。总离子色谱图（TICs）和提取离子色谱图（EICs）以及相应的峰列表被导出并使用Origin 2024（OriginLab，美国马萨诸塞）进行可视化。示意图使用Microsoft Office PowerPoint（微软，美国华盛顿）创建。分子式分配和初步化合物识别基于高分辨率质谱（HRMS）获得的精确m/z值。多元数据分析使用在线平台MetaboAnalyst 6.0（网址：https://www.metaboanalyst.ca/）进行，数据经过中位数归一化、平方根转换和Pareto缩放处理。韦恩图使用EVenn在线工具（网址：http://www.ehbio.com/test/venn/）生成。

在结果与讨论部分，研究人员详细介绍了在线采样接口与SICRIT离子源的开发。SICRIT离子源为挥发性和气态样品的直接分析提供了显著优势，能够实现分析物的即时电离和质谱检测。为了实时监测茶叶样品中的挥发性化合物，开发了与SICRIT离子源耦合的在线加热和传输系统。影响茶叶挥发性物质信号的各种参数被系统地优化。作为冷等离子体电离技术，SICRIT离子源容易受到过度样品沉积导致的通道污染影响。研究人员使用绿茶（黄山毛峰）和乌龙茶（武夷岩茶）评估了不同样品重量（10-100毫克）对信号的影响，如图1C所示。在定义的时间区间内，所选质量信号的平均强度被用作y轴。绿茶表现出显著的重量依赖信号变化，而发酵程度高的乌龙茶则对样品量的敏感性较低。在信号强度与污染风险之间取得平衡后，确定了50毫克作为所有茶叶的样品重量。研究人员还测试了不同的离子源电压（1300 V、1500 V和1700 V），并显示了结果，如图1D所示。信号强度通常随着施加电压的增加而增强，但某些选定离子的信号增强并不明显。基于这一观察，选择了1700 V作为所有后续分析的最优操作电压。使用绿茶作为测试样品，研究人员优化了加热温度，分别测试了120°C、140°C、160°C和180°C，如图1E所示。在较低温度（120-140°C）下，茶叶样品表现出不完全烘烤，颜色变化较小。而较高温度（160-180°C）则实现了更完全的烘烤，但也导致了叶片的明显烧焦。尽管180°C能够快速挥发，但由于过度热降解，信号强度下降，最终选择了160°C作为加热温度。

载体气体的选择会影响信号强度。基于已有文献显示SICRIT离子源在电离效率方面的最佳效果，本研究选择了干燥氮气作为载体气体。通过实验测试，确定了2 L/min为最佳氮气流速，因为该流速下未出现显著的信号波动或实验异常。此外，未加热的不锈钢传输线偶尔会出现挥发性物质冷凝，导致轻微的交叉污染。短传输线长度和氮气辅助的挥发性物质传输有效降低了污染风险。为了确保分析的可靠性和可重复性，当出现样品间交叉污染时，实施了SST传输线的清洁协议。

在线生成的茶叶挥发性物质图谱如图2所示。图中展示了不同茶叶类型在10分钟内检测到的总离子色谱图（TICs）和选定物质的提取离子色谱图（EICs）。加热后观察到清晰的TIC图谱，并根据不同物质的生成顺序，将整个烘烤过程划分为三个阶段：加热阶段（时间阶段1）、挥发性物质阶段I（时间阶段2）和挥发性物质阶段II（时间阶段3）。时间阶段1非常短暂，大约持续0.5-1分钟，茶叶样品被放入加热线圈后迅速加热。随着加热的进行，大量挥发性物质被生成并传输至SICRIT-MS进行电离和检测。时间阶段2大约持续1-4分钟，主要包含低沸点物质，其信号达到峰值并逐渐消失。不同种类的茶叶在此阶段表现出不同的色谱图谱，且不同发酵程度的茶叶含有不同的化合物。在加热4-5分钟后，更多化合物继续被生成并检测，属于时间阶段3。这些化合物包括一些高沸点挥发性物质，以及美拉德反应产物和其他成分。随着加热时间的增加，茶叶样品开始出现褐变和碳化现象，因此实验在10分钟时停止。

除了物质识别，韦恩图被用来展示每种茶叶样品中识别出的物质数量。图4A展示了不同茶叶类型通过SICRIT-MS识别出的信号数量的韦恩图。通常，所有茶叶样品中检测到超过100种物质，其中绿茶信号最多（151种），而白茶信号最少（117种）。该图还显示了六种茶叶类型之间的共有信号和各自独特的信号。结果表明，可以检测到大量具有特征性的挥发性物质，可用于茶叶的产地和类型识别。图4B展示了不同茶叶类型中各类物质的相对数量百分比。所展示的类别包括氮杂环化合物、酯类、胺类、醇类和酚类、酰胺类、氨基酸及其衍生物、醛类和酮类，以及烃类。前四类化合物占总成分的80%以上，显示出不同茶叶样品之间物质类别的具体分布，进一步证明了茶叶种类之间的内在差异。

为了探索不同茶叶样品之间的差异和相似性，研究人员使用烘烤过程中生成的挥发性物质进行了层次聚类分析。如图5所示，选择VIP值大于1的前50个信号生成聚类热图。VIP值大于1通常被视为重要的阈值，表示变量对模型的贡献超过了平均水平。这些物质在本研究中的VIP值大多高于2。显然，所展示的成分在不同茶叶样品中的分布存在差异，每种样品都表现出独特的热图谱，可用于区分和识别。绿茶和黄茶在信号上表现出更大的相似性，并被进一步归为同一组。乌龙茶和黑茶在第一层聚类中聚集在一起，并与红茶在第二层聚类中归为同一组。这些结果与它们的发酵程度一致，其中绿茶、黄茶和白茶的发酵程度相对较低，而乌龙茶、黑茶和红茶的发酵程度较高。

主成分分析（PCA）在不同茶叶样品上进行，结果如图6A所示。不同类型的茶叶形成了不同的聚类，其中主成分1和主成分2分别解释了21.6%和32.8%的方差。乌龙茶、黑茶和红茶被良好区分，而绿茶、白茶和黄茶则聚集在一起，没有明显的重叠。在对应的负载图（图6B）中，远离原点的变量通常代表关键的差异变量，可用于样品分类或解释组间差异。图中标注了一些质量信号，这些信号在所有样品中都有检测，但其强度存在显著差异，例如m/z 112.0757、157.1332和226.1792。其他一些质量信号则具有特定的茶叶特征，例如乌龙茶的m/z 224.0917、白茶的m/z 132.1008和黑茶的m/z 300.2535。PCA和负载图的结果与图3和图5中的质量图谱数据一致。多元数据分析进一步确认了SICRIT-MS方法在表征茶叶种类和识别茶叶样品的特征挥发性物质方面的可靠性和可行性。

为了验证本研究中开发方法的精确度，展示了绿茶、乌龙茶和黑茶的信号在不同天数内的重复性，如补充信息中的表S4所示。样品重复测量的相对标准偏差（RSD）值低于15.0%。Fisher检验在95%置信区间内进行，所有计算的F值均小于相应的F表值，表明良好的重复性和精确度已被实现。

在结论部分，本研究开发了一种用于SICRIT离子源的在线加热和传输系统，使茶叶样品能够直接烘烤，并将生成的挥发性物质实时传输至离子源进行即时电离和质谱分析。尽管未采用分离技术，但挥发性化合物在不同时间段逐步释放并被质谱系统检测。不同化合物在不同时间段内洗脱，各种茶叶类型表现出独特的化学特征。检测到的化合物包括风味物质，如氮杂环化合物、酯类、酚类、醛类、美拉德反应产物和天然成分如氨基酸等。多元数据分析，包括聚类热图、PCA和负载图，展示了所开发的SICRIT-MS方法在根据发酵程度区分茶叶方面的能力。此外，还识别了对茶叶表征起关键作用的质量信号。SICRIT离子源在嗅觉分析中表现出卓越的性能，能够有效检测茶叶样品中的多种挥发性物质和风味成分。所开发的在线采样接口和分析策略在茶叶分析以及其他多种挥发性物质存在的领域中展现出广阔的应用前景，包括材料科学、生物医学研究和环境监测等。

SICRIT离子源以其简单性、紧凑设计、适用于现场应用和快速分析速度而著称。SICRIT与紧凑型质谱系统的集成展示了其在不同领域中扩展便携式质谱应用的显著潜力。这种技术不仅为茶叶质量控制和风味分析提供了新的工具，还为其他需要快速、实时分析挥发性物质的领域提供了创新的解决方案。