SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶天然构象与酶活性的分子力场基准研究：OPLS-AA/TIP3P模型的优化验证

本研究针对SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶（PLpro）药物设计中分子动力学（MD）模拟力场选择的关键问题，系统评估了OPLS-AA、CHARMM27、CHARMM36和AMBER03四种力场结合不同水模型（TIP3P/TIP4P/TIP5P）的性能。通过1μs长程MD模拟发现，OPLS-AA/TIP3P组合在维持催化结构域稳定性和再现Cys111-His272催化对距离方面表现最优，为抗病毒药物虚拟筛选提供了可靠的计算框架。

　　

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的持续变异对全球公共卫生构成严峻挑战，而病毒编码的木瓜样蛋白酶（PL^pro）因其在病毒蛋白加工和免疫逃逸中的双重作用，成为极具潜力的抗病毒靶点。尽管计算机辅助药物设计（CADD）技术已广泛应用于PL^pro抑制剂的开发，但分子动力学（MD）模拟结果的可靠性高度依赖于经验力场（FFs）的选择——不同力场对蛋白质构象的预测差异可达纳米级，这直接影响到虚拟筛选的准确性和药物研发效率。更棘手的是，PL^pro特有的"拇指-手掌-手指"折叠构象和高度可变的BL2环区，使得传统短时程（<200 ns）模拟难以捕捉其完整的构象动力学特征。

针对这一关键问题，研究人员开展了一项系统性力场基准研究。通过构建PL^pro的apo形式（PDB 7SGW）和holo形式（复合物XR8-89抑制剂）体系，采用GROMACS 2019.4软件进行了长达1微秒的MD模拟。研究重点考察了四种主流力场（OPLS-AA、CHARMM27、CHARMM36、AMBER03）与三种水模型（TIP3P/TIP4P/TIP5P）的组合性能，在生理条件（100 mM NaCl，310 K）下评估了蛋白质骨架均方根偏差（RMSD）、残基涨落（RMSF）、回转半径（R_g）等结构参数，特别关注了催化三联体Cys¹¹¹-His²⁷²-Asp²⁸⁶的空间构型保持能力。

在技术方法上，研究采用X射线晶体结构（PDB 7SGW和7LBR）作为初始构象，通过pdb2gmx工具生成拓扑文件，在立方体水盒子（约22,000个水分子）中进行NPT系综模拟。使用v-rescale热浴和Parrinello-Rahman气压控制，设置2 fs积分步长，采用PME方法处理长程静电作用。结构分析借助VMD 1.9.3可视化，通过DSSP算法量化二级结构变化。

研究结果揭示多个重要发现：

3.1 PL^pro结构特征

该酶由315个氨基酸构成，包含N端泛素样（Ubl）结构域、锌结合结构域和催化"拇指-手掌"结构域。关键的催化三联体空间排布在晶体结构中Cα(Cys¹¹¹)-Cα(His²⁷²)距离为0.626 nm，这一参数成为力场评估的关键指标。

3.2 力场性能基准测试

所有力场在短时程（<400 ns）内均能维持PL^pro整体折叠（RMSD<0.4 nm），但CHARMM力场在长时程模拟中表现出N端Ubl域解折叠现象。OPLS-AA力场展现出最佳的催化域稳定性，其Cα-Cα距离偏差<0.1 nm。

3.3 水模型影响

TIP5P模型虽能精确再现X射线晶体参数（Cα-Cα距离误差<2%），但计算成本过高。TIP3P在计算效率与精度间取得最佳平衡，被推荐为标准方案。

3.5 回转半径分析

所有力场的R_g值稳定在2.31-2.39 nm范围，证实蛋白质整体紧凑性保持良好，但对局部构象变化不敏感。

3.6 二级结构演变

DSSP分析显示OPLS-AA能维持β-折叠含量>30%（接近晶体结构的34%），而CHARMM力场出现α-螺旋向无规卷曲的转化。

3.7 复合物稳定性

在PL^pro-XR8-89复合物模拟中，OPLS-AA/TIP3P使抑制剂结合位点RMSD稳定在0.3 nm以下，同时诱导催化对Cα-Cα距离增至1.27 nm，揭示了变构抑制的构象基础。

这项研究的重要意义在于：首次通过微秒级模拟系统评估了PL^pro力场性能，确立了OPLS-AA/TIP3P为最优计算方案。该方案不仅能准确再现酶催化域的天然折叠，还能捕捉抑制剂诱导的变构效应——当非共价抑制剂XR8-89结合BL2沟槽时，催化三联体间距扩大103%，这为理解变构抑制机制提供了结构基础。研究者特别指出，传统短时程（100-200 ns）模拟可能遗漏关键构象变化，建议未来PL^pro抑制剂研究应采用≥500 ns的采样策略。这些发现为抗SARS-CoV-2药物的理性设计建立了可靠的计算生物学框架，相关成果已发表在跨学科期刊《Heliyon》上。