基于重链结合域的三明治ELISA法检测多种食品基质中A型肉毒杆菌毒素的研究

为解决食品中A型肉毒杆菌毒素（BoNT/A）快速检测难题，研究人员以重链受体结合域（RBD）为靶点，开发了一种高灵敏度的三明治ELISA检测方法。该研究在蜂蜜、甜玉米等食品基质中实现了最低1.95 ng/mL的检测限，为食品安全监测和生物防御提供了新型技术手段。

　　

肉毒杆菌毒素（Botulinum neurotoxins, BoNTs）是自然界已知最致命的神经毒素之一，仅1纳克每公斤体重的剂量就足以致命。这种由梭菌属细菌产生的毒素会阻断神经肌肉接头处的信号传递，导致进行性弛缓性麻痹。尽管发病率不高，但食物源性肉毒中毒的后果极为严重，美国疾控中心已将其列为最高级别的生物恐怖武器之一。目前的金标准检测方法——小鼠生物测定法（MBA）虽然灵敏度高，但存在伦理争议且操作复杂。如何在复杂食品基质中实现快速、灵敏的BoNT检测，成为食品安全和生物防御领域的重大挑战。

针对这一难题，国防研究与发展机构（Defence Research and Development Establishment, DRDO）的研究人员创新性地选择BoNT/A重链的受体结合域（Receptor-Binding Domain, RBD）作为检测靶点，开发了一种新型三明治ELISA检测方法。相关研究成果发表在《Journal of Food Composition and Analysis》上，为食品安全的快速监测提供了重要技术手段。

研究团队主要采用了以下关键技术：通过PCR扩增获得1287bp的RBD基因片段，克隆至pET-28b(+)载体并在E. coli BL21 DE3中表达；采用Ni⁺-NTA树脂纯化重组蛋白；以兔源抗RBD IgG作为捕获抗体、鼠源抗RBD IgG作为检测抗体建立三明治ELISA体系；在不同食品基质中进行加标回收实验验证方法适用性。

【PCR扩增和BoNT/A RBD蛋白表达】

研究成功扩增出1287bp的RBD基因片段，经克隆和表达后获得预期大小的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot验证显示，纯化的RBD蛋白具有良好反应原性。

【BoNT/A RBD蛋白纯化】

通过Ni⁺-NTA亲和层析获得高纯度RBD蛋白，为后续抗体制备和检测体系建立奠定基础。

【讨论】

与传统的MBA相比，该ELISA方法在纯化抗原检测中灵敏度达0.97 ng/mL，在蜂蜜和甜玉米中检测限为1.95 ng/mL，在肉类等复杂基质中为3.9 ng/mL，在饮料中为7.81 ng/mL。研究证实RBD作为替代靶点具有显著优势：其表面暴露特性避免了毒素前体需要酶切激活的步骤，且在不同食品基质中表现稳定。

【结论】

该研究建立的RBD靶向三明治ELISA检测体系具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优势，为食品源性肉毒中毒的早期诊断和生物恐怖袭击的快速应对提供了有效工具。研究团队特别指出，未来需要在实际样本中进一步验证该方法的可靠性，以推动其在食品安全监测和公共卫生应急体系中的应用。

研究由Jyotsna Dhubkarya等人完成，通讯作者为Sarkaraisamy Ponmariappan。论文标注为DRDE-IREC-138-30082024，所有作者声明无利益冲突。国防研究与发展组织（DRDO）为本研究提供了经费和技术支持。