活体与早期死后人类视网膜单细胞转录组对比图谱揭示细胞状态动态差异

本研究通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，首次系统比较了活体和早期死后人类视网膜组织的转录组差异。研究人员采集9例未冷冻样本（5例治疗性眼球摘除后10分钟内获取的活体组织，4例死后6小时内获取的组织），构建了包含106,829个细胞的参考图谱，发现了一个新型光感受器亚群ELF1-mlCone，并通过RNA速度分析揭示了活体组织特有的转录动态特征。该研究为视网膜研究提供了重要资源，强调了组织活性状态对单细胞分析的影响。

　　

人类视网膜作为视觉系统的核心组成部分，其复杂的细胞组成和精细的神经环路一直是神经科学和眼科学研究的热点。然而长期以来，视网膜研究面临着一个尴尬的困境：由于伦理和技术限制，绝大多数研究都依赖于死后捐赠的组织样本。这些样本虽然为理解视网膜结构提供了重要信息，但死后变化不可避免地会影响研究结果的可靠性。特别是对于单细胞RNA测序(scRNA-seq)这类高分辨率技术，组织活性状态可能显著影响对细胞状态和动态过程的解析。

更令人担忧的是，现有的人类视网膜单细胞研究存在明显的样本局限性。一方面，研究多采用冷冻保存或死后组织，无法反映真实的生理状态；另一方面，样本来源往往局限于特定视网膜区域（如中央凹或周边视网膜），难以全面反映视网膜的细胞多样性。此外，虽然单核RNA测序(snRNA-seq)扩展了冷冻样本的应用范围，但这种方法只能捕获核内RNA，可能遗漏关键的胞质信息及瞬时生物学过程。这些限制严重制约了我们对人类视网膜在生理状态下真实细胞组成和功能的理解。

针对这些关键问题，宁波诺丁汉大学卓越灯塔创新研究院的研究人员开展了一项开创性研究。他们首次系统比较了活体和早期死后人类视网膜的单细胞转录组特征，构建了一个包含106,829个细胞的参考图谱。这项发表在《Human Genomics》的研究不仅揭示了视网膜细胞组成的基线数据，更重要的是发现了活体组织特有的转录动态特征，为未来视网膜研究提供了重要方法论参考。

研究人员采用了多项关键技术：从5例活体（治疗性眼球摘除后10分钟内获取）和4例死后（6小时内获取）供体采集全层视网膜样本；使用10x Genomics 3'RNA-seq平台进行单细胞转录组测序；应用scVI算法进行批次校正和整合分析；通过Leiden聚类和经典标记基因注释主要细胞类型；采用SCENIC分析转录因子调控网络；利用Dynamo进行RNA速度分析；通过CellChat推断细胞间通讯网络。特别值得注意的是，研究还使用来自2例额外供体的4个样本进行了独立验证。

研究结果部分呈现了丰富发现：

在"Single-cell transcriptomic analysis of human retina from living and cadaveric donors"部分，研究人员成功鉴定了视网膜所有主要细胞类型，包括视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、Müller胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、T细胞和视网膜神经节细胞。视杆细胞是最主要的细胞类型（占42.76-90.53%），其次是Müller胶质细胞（6.27-26.21%）和双极细胞（4.67-23.24%）。与人类细胞图谱(HCA)整合数据的比较显示，不同研究间细胞比例存在显著差异，这可能是由于采样区域和技术因素所致。

"Bipolar cells"部分详细描述了12种双极细胞亚型，包括6种ON型（DB5、DB6、BB+GB、IMB等）和6种OFF型（DB1、DB2、DB3a、DB3b、FMC、OFFx）。ON型双极细胞通过mGluR6受体传递光起始信号，而OFF型则通过离子型谷氨酸受体(AMPA和Kainate)对光终止产生反应。视杆双极细胞(RBC)在弱光视觉中起关键作用，将信号从视杆细胞传递至AII无长突细胞，再转至视锥双极细胞和视网膜神经节细胞。

"Amacrine cells"部分鉴定了5个无长突细胞群体：3个GABA能簇（GABA-AC1、GABA-AC2、GABA-AC3）、1个甘氨酸能簇(GlyACs)和1个中间簇。功能分析显示这些亚型具有不同的突触特性和信号调节功能。GABA-AC1与谷氨酸能突触和突触膜相关；GABA-AC2与突触后密度和光感受器外段相关；GABA-AC3则主要参与离子通道活动和钙信号传导。

"Cone photoreceptors"部分是最具创新性的发现之一。研究人员在中等/长波长敏感视锥细胞(mlCone)中发现了一个新的亚群ELF1-mlCone，其特征是突触相关基因（KCNB2、CADPS、RIMS2）表达增强和代谢基因表达下调。SCENIC分析显示ELF1是这个亚群的关键转录因子，与SETDB1、RCOR1和SREBF1共同构成特异的调控模块。细胞通讯分析表明ELF1-mlCone具有更特异的相互作用模式，与普通mlCone的广泛互作形成对比。在独立验证实验中，ELF1-mlCone的存在和特征得到了证实。

"Living vs. post-mortem analysis validates transcriptional dynamics"部分比较了活体和死后组织的转录动态差异。RNA速度分析显示，活体样本具有明确的方向性流动，特别是从mlCone向ELF1-mlCone的转变；而死后样本则表现出紊乱的模式。在双极细胞中，活体样本显示出清晰的亚型间转换路径，而死后样本的这些模式被显著破坏。

这项研究的结论部分强调了三个重要贡献：首先，建立了人类视网膜细胞类型比例的参考基线，为未来研究提供了重要对照；其次，发现并验证了ELF1-mlCone这一新的视锥细胞状态，其特征是突触机制增强和代谢重编程；最后，通过活体与死后样本的直接比较，证明了组织活性状态对单细胞转录组分析的重要影响，特别是对细胞状态转换和动态过程的解析。

该研究的科学意义主要体现在三个方面：方法学上，证明了活体组织分析在捕捉真实细胞状态方面的优势，为未来单细胞研究设计提供了重要参考；生物学上，发现的ELF1-mlCone亚群可能代表了视锥细胞的一种特殊功能状态，为理解视网膜信号处理提供了新视角；临床应用上，建立的人类视网膜参考图谱可作为疾病研究的基准，特别是对于糖尿病视网膜病变等疾病的机制研究具有重要价值。

值得注意的是，研究也存在一些局限：ELF1-mlCone的功能意义仍需进一步验证；样本量相对有限（9例发现样本+4例验证样本）；活体样本均来自病理状态的眼球（如角膜葡萄肿、眼球萎缩等），可能不完全代表健康视网膜。未来研究可通过类器官模型或空间转录组技术进一步探索ELF1-mlCone的空间分布和功能特性。总体而言，这项研究为人类视网膜生物学研究树立了新标准，凸显了在可能情况下使用活体组织的重要性。