枯草芽孢杆菌中YcnI与YcnJ介导的铜离子交换机制及其在铜稳态调控中的作用

本研究揭示了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过YcnJCopC和YcnIDUF1775结构域的高亲和力Cu(II)结合与交换机制，解析了二者在铜限制条件下协同调控铜摄取的分子基础。研究人员结合X射线晶体学、ITC和遗传学实验，证实Cu(II)可在两蛋白间双向转移，且关键位点突变导致生长缺陷。该发现为理解细菌铜稳态提供了新范式，发表于《Journal of Biological Chemistry》。

　　

铜作为生命体必需的微量元素，在细菌能量代谢和氧化应激防御中发挥关键作用。然而，革兰氏阳性模式菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)如何在外界铜浓度波动时精准调控铜的吸收与分配，一直是微生物金属稳态领域的未解之谜。尤其令人困惑的是，其基因组中的ycnKJI操纵子编码的膜蛋白YcnI和YcnJ均含有预测的铜结合结构域，但二者的协同机制及其生理意义尚未阐明。

针对这一科学问题，来自康奈尔大学(Cornell University)的研究团队通过多学科交叉方法，首次揭示了YcnJ的CopC结构域以1:1化学计量比结合Cu(II)的分子机制，并发现其与YcnI的DUF1775结构域之间存在动态铜交换现象。这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究，不仅阐明了细菌铜获取的新途径，更提出了"膜外铜库"调控模型，为理解微生物适应金属饥饿环境的进化策略提供了重要线索。

研究人员主要运用了四种关键技术：X射线晶体学解析了YcnJ^CopC的1.60 ?分辨率结构；等温滴定量热法(ITC)测定其Cu(II)结合亲和力达0.14 fmol/L；电子顺磁共振(EPR)证实Cu(II)的轴向配位环境；以及基于CRISPR-Cas9的枯草芽孢杆菌基因编辑构建系列突变株。

结构解析揭示保守结合位点

通过重组表达和晶体学研究，发现YcnJ^CopC采用典型的cupredoxin折叠，其Cu(II)结合位点由N端组氨酸(His24)、DxH模体中的His110和Asp112构成"组氨酸支架"(histidine brace)，与甲基球菌(Methylosinus trichosporium)的CopC蛋白结构高度相似。值得注意的是，β4链的构象变化可能参与铜结合后的构象重排。

超高亲和力的铜捕获能力

ITC竞争实验显示YcnJ^CopC对Cu(II)的亲和力比YcnI^DUF1775高一个数量级，这与EPR检测到的特征性超精细分裂谱线(g_|| = 2.257, A = 17.86 mT)共同证实其三氮一氧的配位环境。这种femtomolar级别的结合能力，使细菌能在铜稀缺环境中有效捕获痕量金属。

遗传学验证生理功能

使用铜螯合剂TETA模拟限铜条件时，ΔycnJ菌株表现出生长速率和生物量双重缺陷，而ΔycnI仅影响最终产量。关键的是，His24Ala/His110Ala双突变完全重现了ΔycnJ表型，证实CopC域的铜结合功能不可或缺。YcnI的Trp137Phe突变则破坏了其通过π-π堆砌稳定铜位点的能力，导致类似缺失突变体的生长缺陷。

双向铜交换的分子对话

体外实验首次证明：Cu(II)可在YcnJ^CopC与YcnI^DUF1775间双向转移，但存在从YcnJ到YcnI的偏好性。透析实验排除了游离铜介导的被动转移，表明需要蛋白间瞬时相互作用。AlphaFold预测的复合物模型显示，铜离子可能位于两结构域界面，且YcnJ^CopC的构象变化可能促进铜向膜内CopD域的传递。

这项研究建立了细菌铜获取的新范式：YcnI可能作为"膜外铜库"暂存铜离子，而YcnJ^CopC则发挥铜传递枢纽作用，二者协同确保铜限制条件下的高效摄取。这种细胞外金属交换机制，不同于经典的周质空间铜伴侣系统，为理解革兰氏阳性菌的金属稳态调控提供了全新视角。从应用角度看，针对YcnI-YcnJ互作界面的抑制剂设计，可能成为控制病原菌铜代谢的新型抗菌策略。