RNA化学探针试剂对RNA结合蛋白的影响：分子机制与实验验证

研究人员发现RNA化学探针（如1M7、DMS）在探测RNA结构时，会共价修饰RNA结合蛋白（RBP）的氨基酸侧链，从而干扰蛋白-RNA相互作用。通过分子动力学（MD）模拟、MALDI-MS和NMR等技术，团队证实1M7可酰化hnRNP K KH3的酪氨酸和赖氨酸，而DMS修饰作用较弱。该研究揭示了化学探针在解析RNA-蛋白互作界面时的潜在偏差，强调需结合正交方法验证结合位点，为RNA-蛋白互作研究提供了重要方法论参考。

　　

在探索RNA结构与功能的征程中，化学探针技术犹如一把"分子尺子"，能够精确测量RNA单链区域的灵活性。选择性2'-羟基酰化（SHAPE）和二甲基硫酸盐（DMS）等试剂通过共价标记未配对的核苷酸，为科学家们绘制RNA二级结构图谱提供了关键数据。然而，这些高活性试剂就像"双刃剑"，在标记RNA的同时，是否会对与其相互作用的蛋白质"误伤"？这个潜在问题长期被学界忽视，却可能直接影响蛋白-RNA互作研究的准确性。

纽约大学（New York University）的研究团队通过多学科交叉研究，首次系统揭示了RNA化学探针与RNA结合蛋白（RBP）的"副反应"机制。发表在《Journal of Biological Chemistry》的这项研究，结合分子动力学（MD）模拟、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）和核磁共振（NMR）三大技术，证明常用探针1M7会共价修饰hnRNP K KH3结构域的关键氨基酸，而DMS的修饰作用较弱。这一发现为正确解读化学探针实验数据提供了重要警示。

研究采用三大关键技术：分子动力学模拟追踪探针-蛋白相互作用位点；MALDI-MS检测蛋白共价修饰；NMR分析修饰对蛋白结构的影响。以hnRNP K KH3和WDR5为模型，通过滤膜斑点杂交和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证修饰对RNA结合能力的影响。

MALDI-MS揭示蛋白质共价修饰

质谱分析显示，1M7处理后的hnRNP K KH3出现单、双及多重修饰峰，分子量增加显著（18 mM处理时未修饰蛋白仅占少量）。2A3修饰效率最高（36 mM时未修饰蛋白几乎消失），而DMS和BzCN未引起明显修饰。SHARP RRM1也呈现类似修饰模式，证实该现象的普遍性。

MD模拟定位探针结合热点

通过1μs分子动力学模拟发现，1M7在hnRNP K KH3中富集于Tyr75/Tyr84周围，临近RNA结合关键位点Glu42/Ser80；在SHARP RRM1中则偏好结合His7/Trp9等芳香族氨基酸。相比之下，DMS结合更短暂（10-30 ns），解释其较弱修饰活性。

NMR精确定位修饰位点

核磁共振谱显示1M7处理导致hnRNP K KH3广泛信号展宽/位移，尤其影响Gly30、Gln34等残基。质谱鉴定出Lys31/Lys48为修饰位点，且Arg35-Tyr84芳香-阳离子相互作用可能催化酪氨酸酰化。值得注意的是，这些修饰位点与polyC RNA结合区域高度重叠。

化学探针干扰WDR5-RNA结合

在功能性验证中，1M7修饰使WDR5与lncRNA UMLILO的结合亲和力从4.4 μM降至>25 μM。预形成的RNA-蛋白复合物经1M7处理后也发生解离，证实修饰可破坏现有相互作用。

这项研究揭示了一个长期被忽视的实验偏差来源：化学探针在标记RNA的同时，会通过共价修饰改变蛋白质的RNA结合界面。特别是1M7等酰化试剂对酪氨酸、赖氨酸的修饰，可能干扰蛋白-RNA互作的关键氨基酸。研究强调在利用化学探针解析RNA-蛋白复合物时，必须结合EMSA、NMR等正交方法验证结合位点。有趣的是，这种"副作用"也可能转化为优势——化学探针或将成为探测蛋白质表面活性氨基酸的新工具。该成果为RNA结构生物学研究提供了重要方法学参考，对精准解析非编码RNA功能机制具有深远意义。