精进DNA修复调控：一种在鼠胚中实现通用高效基因敲入的ChemiCATI策略

本研究针对CRISPR依赖的基因敲入技术中sgRNA设计与筛选耗时费力的问题，开发了ChemiCATI策略。通过调控DNA双链断裂修复路径（抑制NHEJ并促进MMEJ向HDR转化），结合AZD7648化合物和Polθ（Polq）敲降，在十余个基因组位点实现高达90%的敲入效率，为动物模型构建和基因治疗提供了新工具。

　　

在基因编辑领域，CRISPR/Cas9技术虽已实现精准基因组修饰，但依赖同源定向修复（HDR）的基因敲入效率仍受限于DNA修复路径的随机性。尤其在小鼠胚胎等珍贵样本中，传统方法需针对不同靶位点反复优化sgRNA，耗时且成功率不稳定。中国科学院神经科学研究所的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，通过解析DNA修复路径竞争机制，开发出突破性的ChemiCATI策略，为基因编辑领域提供了通用解决方案。

研究采用胚胎显微注射、RNA编辑工具CasRx介导的基因敲降、高通量测序分析和化合物筛选等关键技术。通过构建包含B6D2F1小鼠胚胎的实验体系，结合ICE分析和深度测序验证，系统评估了不同修复路径对敲入效率的影响。

MMEJ修复模式与敲入效率的正相关性

通过分析Actb和Cdx2等位点的修复模式，发现微同源介导末端连接（MMEJ）主导的sgRNA（如Cdx2-sgRNA6，N/M=0.23）比非同源末端连接（NHEJ）主导的sgRNA（如Actb-sgRNA2，N/M=1.24）敲入效率高3倍。单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）模板实验均证实该规律（图1G，图2L）。

修复路径调控的递进优化

• Polθ敲降（CATI方法）选择性提升MMEJ偏好位点的HDR效率（如Sod1-A4-sgRNA5从38%增至96%），但对NHEJ偏好位点无效（图3D-E）。

• 化合物筛选发现DNA-PKcs抑制剂AZD7648能将NHEJ修复转化为MMEJ模式（如Sod1-G93-sgRNA3的N/M从0.95降至0.34），显著提高NHEJ位点敲入效率（图4B-C）。

ChemiCATI策略的普适性验证

联合AZD7648与Polθ敲降后：

• 在Slbp和Cenpe基因位点实现100%的精准编辑（表1）

• 神经发育相关基因Grin2a和Trio的敲入效率提升2倍（补充图17）

• 全基因组测序显示未增加脱靶或大片段缺失风险（补充图15-16）

该研究首次阐明胚胎中DNA修复路径的动态平衡机制，提出的ChemiCATI策略突破了对特定sgRNA的依赖。通过化学-遗传联合调控，将NHEJ→MMEJ→HDR的路径转化效率最大化，为构建复杂疾病模型和临床级基因编辑提供了新范式。尤其对肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病相关突变（如Sod1-G93A）的精准建模具有重要价值。