斑马鱼侧线器官中细胞类型特异性CyclinD基因独立调控干细胞与祖细胞增殖的机制研究

本研究通过单细胞转录组分析和基因编辑技术，揭示了斑马鱼侧线感觉器官中ccndx和ccnd2a基因分别特异性调控毛细胞祖细胞和扩增干细胞的增殖。研究发现Notch信号通过抑制ccndx表达控制再生过程中的细胞分裂，而ccndx缺失导致的增殖缺陷会引发hes2/Emx2通路失调，进而破坏毛细胞极性建立。该工作为对称分裂细胞的增殖调控提供了新范式，对再生医学和疾病治疗具有重要启示。

　　

在生物体组织稳态维持和再生过程中，对称分裂的成体干细胞通过精确的增殖调控实现自我更新与分化。然而，干细胞及其分化后代是否采用不同的增殖调控机制，一直是未解之谜。斑马鱼侧线感觉器官作为研究器官再生和细胞命运的经典模型，其毛细胞再生过程涉及两种增殖细胞群：位于背腹极的扩增干细胞（amplifying stem cells）和中央区的毛细胞祖细胞（hair cell progenitors）。传统观点认为细胞增殖是再生的必要条件，但这一假设缺乏分子层面的证据。

为揭示这一机制，研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术发现cyclinD家族成员ccndx和ccnd2a分别特异性表达于毛细胞祖细胞和扩增干细胞。通过CRISPR-Cas9基因编辑构建ccndx突变体后，观察到毛细胞祖细胞增殖完全缺失，但令人惊讶的是，毛细胞仍能通过直接分化再生，只是数量减半。这表明增殖并非再生的绝对前提，颠覆了既往认知。进一步实验显示，ccnd2a缺失仅影响发育阶段的扩增干细胞分裂，而再生过程中其他cyclinD基因可能代偿其功能。

研究采用的关键技术包括：1）转基因斑马鱼品系构建与活体成像追踪细胞命运；2）单细胞转录组分析揭示细胞类型特异性基因表达；3）CRISPR-Cas9/Cas12a系统构建基因突变体；4）杂交链式反应（HCR）原位杂交精确定位基因表达；5）药理学干预Notch信号通路。

ccndx-/- neuromasts form new hair cells in the absence of proliferation

通过EdU标记和延时成像证实，ccndx缺失导致毛细胞祖细胞无法进入S期，但单个祖细胞仍能分化为单个毛细胞（野生型通常产生两个）。值得注意的是，传统细胞周期抑制剂阿非迪霉素（aphidicolin）导致的再生失败实为药物毒性效应，而非增殖缺失本身所致。

ccnd2a drives amplifying cell divisions but substitutes for ccndx if expressed in progenitor cells

发育阶段ccnd2a缺失使扩增干细胞增殖减少75%，但该表型在再生阶段消失，提示功能代偿机制。将ccnd2a置于ccndx启动子下可完全挽救ccndx突变体的增殖缺陷，证实cyclinD的功能差异源于表达模式而非蛋白特性。

Notch signaling represses ccndx expression in hair cell progenitors

Notch报告基因与ccndx表达呈互补分布，γ-分泌酶抑制剂LY411575处理显著上调ccndx表达。单细胞数据显示Notch抑制后ccndx与毛细胞决定因子atoh1a同步激活，但atoh1a缺失实验证实二者调控相互独立。

ccndx-/- progenitors and hair cells differentiate normally but exhibit polarity defects

极性分析显示突变体70%毛细胞呈现后向极性（野生型为50%），伴随转录因子Emx2表达异常。单细胞测序发现hes2.2在ccndx-/-祖细胞中显著下调，而强制表达hes2.2可逆转极性缺陷，证实"ccndx→hes2→Emx2"调控轴的存在。

这项研究建立了对称分裂细胞群体中独立增殖调控的范式：1）不同cyclinD基因通过时空特异性表达精确调控干细胞与祖细胞增殖；2）增殖与分化在分子水平上解耦；3）细胞分裂通过hes2/Emx2通路参与极性建立。这些发现不仅为理解器官再生中的细胞行为提供新视角，也为癌症（异常增殖）和前庭功能障碍（毛细胞极性缺陷）等疾病的治疗靶点开发奠定理论基础。研究揭示的"增殖非必需"现象可能重塑再生医学领域的实验设计范式，提示需区分真实的增殖依赖性与药物毒性效应。