抗生素-CRISPRi全基因组筛选揭示LiaR激活作为恢复耐氟喹诺酮肺炎链球菌敏感性的新策略

为解决氟喹诺酮类抗生素耐药性问题，Bevika Sewgoolam等研究人员通过CRISPRi-seq全基因组筛选，鉴定出DNA修复基因recA/recF和细胞膜应激调控系统LiaFSR在氟喹诺酮压力下的关键作用。研究发现LiaS缺失导致LiaR过度磷酸化，激活SpxA2和热休克反应通路，显著增强细菌对环丙沙星（CIP）和左氧氟沙星（LEV）的敏感性。创新性提出杆菌肽（BAC）与氟喹诺酮联用方案，在斑马鱼脑膜炎模型中成功恢复耐药菌株敏感性，为临床联合用药提供新思路。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，其中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）对氟喹诺酮类抗生素的耐药性问题日益突出。这类通过抑制拓扑异构酶发挥作用的广谱抗生素，曾是治疗社区获得性肺炎的重要选择，但耐药菌株的出现使其临床效用大打折扣。更令人担忧的是，世界卫生组织已将肺炎链球菌列为急需新型抗生素的优先病原体。在此背景下，瑞士洛桑大学（University of Lausanne）的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究，通过创新性的全基因组筛选技术，发现了一条逆转耐药性的全新通路。

研究人员采用CRISPR干扰测序（CRISPRi-seq）技术，对肺炎链球菌D39V菌株进行全基因组范围的基因必要性分析，重点考察了环丙沙星（CIP）、莫西沙星（MOX）和左氧氟沙星（LEV）三种氟喹诺酮类抗生素的压力响应。实验设计包含诱导型dCas9系统的1498个sgRNA文库，通过Illumina测序定量sgRNA丰度，结合DESeq2进行差异分析。此外还运用RNA-seq解析转录调控网络，并通过斑马鱼胚胎脑膜炎模型验证体内疗效。

CRISPRi-seq揭示氟喹诺酮压力下的基因必要性图谱

研究首先构建了全基因组CRISPRi文库，在亚抑制浓度抗生素条件下筛选出44个差异必需基因。其中26个基因（如recA、recF、recJ等DNA修复相关基因）的敲低导致细菌适应性下降，而18个基因（如翻译延伸因子efp）的抑制反而增强细菌存活。特别值得注意的是，细胞膜应激感应系统LiaFSR的sgRNA显著富集，暗示其与氟喹诺酮敏感性存在意外关联。

RecFOR系统在DNA损伤修复中的关键作用

通过构建recF和recJ条件性敲除株，证实单链DNA缺口修复途径对细菌存活至关重要。实验显示，在左氧氟沙星（LEV）压力下，这些突变株生长严重受限，而添加IPTG恢复基因表达后可挽救表型。这一发现印证了氟喹诺酮通过造成DNA双链断裂（DSBs）发挥杀菌作用的经典机制。

翻译延伸抑制与抗生素拮抗现象

研究发现efp基因缺失或氯霉素（CHL）处理能拮抗LEV的杀菌效果，表明蛋白质合成延伸步骤可能参与调控氟喹诺酮的致死效应。这一发现为理解抗生素交叉作用提供了新视角。

LiaFSR系统的意外角色与机制解析

通过系列基因敲除实验，研究锁定组氨酸激酶LiaS是调控氟喹诺酮敏感性的关键开关。RNA-seq显示△liaS突变株中LiaR调节子（包括热休克蛋白和氧化应激调控因子SpxA2）显著上调。进一步实验证实，LiaS主要作为磷酸酶维持LiaR非活性状态，而BAC等膜靶向抗生素能诱导LiaR磷酸化，激活下游通路。

从机制到治疗的转化

基于上述发现，研究创新性地提出BAC与氟喹诺酮联用方案。体外实验显示，BAC能将耐药临床株（如FQR_25191）的LEV MIC从32μg/mL降至4μg/mL。斑马鱼感染模型证实，联合治疗使D39V感染存活率从33.3%提升至75.6%，对耐药株也有显著效果。

这项研究的重要意义在于：首次将细胞膜应激响应与氟喹诺酮敏感性相联系，突破性地发现LiaFSR-SpxA2通路可作为"耐药性断路器"。提出的BAC联合疗法不仅具有临床转化潜力，其揭示的"膜应激增敏"机制更为设计新型抗生素组合提供了范式。研究采用的CRISPRi-seq技术平台也展示了全基因组筛选在发现新型药物靶点方面的强大能力，为应对全球抗生素耐药危机开辟了新思路。