仿生双梯度生物效应支架促进腱-骨界面修复的细胞分化调控研究

这篇研究创新性地设计了一种具有羟基磷灰石纳米棒（HAp）和刺猬信号通路激动剂（HhAg）双梯度分布的仿生支架，通过漏斗形微通道结构引导人间充质干细胞（hMSC）梯度分化为成骨细胞、软骨细胞和肌腱细胞，成功模拟天然腱-骨附着处的细胞表型连续过渡。该研究为腱-骨界面再生提供了兼具机械适配性和生物诱导性的新型解决方案。

　　

1 引言

旋转袖损伤修复面临的核心挑战在于腱-骨界面天然存在的成分-结构空间梯度难以重建。天然腱-骨附着处（腱止点）呈现从肌腱→非矿化纤维软骨→矿化纤维软骨→骨的连续过渡，需要多种细胞表型的空间有序排列。现有多相支架存在相间突变导致的应力集中问题，而聚合物移植物又缺乏精确的细胞表型空间调控能力。本研究提出通过聚己内酯（PCL）基双梯度支架，协同调控HAp纳米棒（成骨效应因子）与HhAg（腱止点纤维软骨效应因子）的梯度分布，引导hMSC的梯度分化。

2 结果与讨论

2.1 仿生支架的制备与表征

采用水热法合成尺寸均一的HAp纳米棒（130±20 nm×10±2 nm），XRD证实其六方晶系结构。通过扩散法构建HAp+HhAg/PCL双梯度薄膜，飞秒激光加工形成245.3±10.0 μm孔径的漏斗形微通道阵列（倾角60.8±3°）。拉曼光谱显示P-O特征峰（960 cm^-1）强度从顶部到底部递增，EDX证实钙元素含量底部比顶部高6.8倍，ToF-SIMS通过氯元素示踪证实HhAg的梯度分布。纳米压痕测试显示支架杨氏模量从顶部0.62 GPa梯度增至底部1.39 GPa，与HAp含量变化正相关。

2.2 生物相容性与细胞行为

活/死染色显示24小时后hMSC在支架各区域存活率>95%，CCK8检测显示3天内细胞持续增殖。肌动蛋白染色和SEM观察证实细胞沿微通道壁锚定伸展，伪足与通道壁形成紧密接触。区域特异性CCK8检测显示顶部、中部、底部细胞活性无显著差异。

2.3 效应因子的生物学作用机制

RT-qPCR证实HAp纳米棒可显著上调成骨标志基因：骨桥蛋白（OPN）表达提升9.8倍，骨钙素（OCN）3.8倍，RUNX2 13.2倍。茜素红染色显示21天时HAp组矿化程度显著高于对照组。HhAg处理组中Hh信号通路标志物Ptch1、Gli1/2/3表达分别上调1.3、7.0、1.6和1.6倍，证实其通过Smo受体激活下游信号传导。

2.4 梯度分化验证

21天培养后，双梯度支架呈现明确的表型空间分布：顶部区域高表达肌腱标志物硬骨蛋白（SCXA），中部富集肥大软骨标志物X型胶原（Col-10），底部OPN表达量达顶部2.3倍。荧光强度定量显示：SCXA沿微通道自上而下递减，Col-10呈先增后减趋势，OPN持续递增。这种分布与天然腱止点的细胞表型梯度高度吻合。

3 结论

该双梯度支架通过HAp纳米棒的机械-化学协同效应与HhAg的信号通路调控，实现了hMSC向三种谱系的时空特异性分化。漏斗形微通道结构不仅促进细胞快速浸润，还通过壁面效应因子的梯度暴露精确引导细胞命运。这种"结构-效应因子"双仿生策略为界面组织再生提供了新范式。

4 实验方法

关键实验包括：水热法制备HAp纳米棒，扩散-蒸发法制备梯度薄膜，飞秒激光加工微通道。细胞实验采用hMSC（Lonza来源），培养于α-MEM+10%FBS。检测手段涵盖：SEM/TEM形貌分析，EDX/Raman成分表征，RT-qPCR（引物见表S1），免疫荧光（抗体信息见材料部分），纳米压痕力学测试等。统计采用GraphPad Prism 10.0进行双尾t检验。