PL17家族褐藻酸裂解酶催化口袋关键环决定最小底物识别机制

研究人员针对褐藻酸寡糖(AOSs)降解过程中PL17家族寡藻酸裂解酶(Oals)的底物识别机制不明这一关键问题，通过比较研究Vibrio alginolyticus中VaAly17A和VaAly17B的功能差异，首次发现活性凹槽中的Loop1结构决定酶的最小底物识别模式。该研究为区分PL17家族Oals的功能特征提供了新策略，对褐藻生物精炼具有重要意义。

　　

褐藻作为海洋中储量最丰富的生物质资源之一，其细胞壁主要成分褐藻酸的高效降解是实现生物精炼的关键瓶颈。尽管已知褐藻酸降解需要多种裂解酶协同作用，但不同寡藻酸裂解酶(Oals)在代谢中的具体分工机制仍不清楚，特别是决定其最小底物识别的结构基础尚未阐明。这一科学问题的解决，将直接影响褐藻生物转化效率的提升。

山东大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的重要研究中，以典型褐藻降解菌Vibrio alginolyticus ATCC 17749为模型，首次揭示了PL17家族Oals中决定最小底物识别的关键结构元件。研究人员通过比较基因组学发现，所有褐藻降解弧菌都保守存在VaAly17A和VaAly17B这对串联排列的PL17酶。功能研究表明，VaAly17A专门降解三糖及以上寡糖，而VaAly17B仅作用于二糖，这种分工协作实现了褐藻酸寡糖的阶梯式降解。

研究运用了多项关键技术：通过基因敲除和回补实验验证体内功能；采用酶动力学分析比较底物特异性；运用AlphaFold2预测蛋白结构并进行分子对接；创新性地设计Loop1结构域互换实验；结合HPLC和ESI-MS精确鉴定降解产物。

研究结果部分：

1. A PL17 Oal pair occurs in alginate-degrading Vibrio species

   生物信息学分析揭示所有褐藻降解弧菌都保守存在PL17酶对，VaAly17A与VaAly17B分别属于PL17_2亚家族，序列相似性63%。

2. VaAly17A, but not VaAly17B, is required for the growth of alginate

   敲除实验显示VaAly17A是藻酸代谢必需酶，而VaAly17B缺失仅导致延滞期延长，表明二者功能分化。

3. VaAly17A and VaAly17B exhibit different biochemical characteristics in vitro

   酶学分析发现VaAly17A最适温度30°C，对多糖活性达114 U/mg；VaAly17B最适20°C，对多糖活性仅3.2 U/mg。

4. A stepwise degradation of AOSs is achieved by VaAly17A and VaAly17B

   产物分析证实VaAly17A最小底物为三糖，VaAly17B专一降解二糖，形成阶梯式降解途径。

5. Length of a loop around the active groove determines the minimum recognition patterns

   结构分析发现活性凹槽中Loop1长度差异是关键：VaAly17A短Loop1形成开放凹槽容纳大底物，VaAly17B长Loop1限制空间仅结合二糖。

6. VaAly17B is important to eliminate accumulated disaccharides and maintain intracellular redox homeostasis

   ΔVaAly17B突变体NAD⁺/NADH比值显著降低，证实二糖积累破坏氧化还原稳态。

这项研究首次阐明PL17家族Oals中Loop1结构决定最小底物识别的分子机制，突破性地提出该结构域可作为区分酶功能的分子标志。不仅完善了褐藻降解的酶学理论，更为理性设计高效褐藻降解酶系提供了结构基础。研究建立的"结构域-功能"预测模型，可广泛应用于多糖裂解酶的功能预测与改造，对发展海洋生物质精炼技术具有重要指导价值。