基于稳定同位素衍生化与电喷雾串联质谱联用技术的生物样本脂肪酸高灵敏度分析方法研究

本研究针对游离脂肪酸(FFAs)质谱分析中电离效率低、缺乏特征碎片离子的难题，开发了稳定同位素衍生化(ID)结合液相色谱-三重四极杆质谱(ID-LC-QQQ-MS)的新方法，通过生成FA-TMAE-h3/d3衍生物实现中性丢失扫描(QNLS)非靶向筛查和多重反应监测(MRM)相对定量，成功应用于叙利亚金黄地鼠血清23种FFAs的代谢差异分析，为心血管疾病等脂代谢异常研究提供了创新技术平台。

　　

脂肪酸作为细胞膜的重要组成和能量代谢的关键介质，其异常波动与心血管疾病、脂肪肝等多种疾病密切相关。然而这些含12-26个碳原子的分子在质谱检测中面临两大瓶颈：一是电喷雾电离负离子模式(ESI-)灵敏度不足，二是缺乏特征性碎片离子导致定性困难。传统气相色谱法又受限于分析物的热稳定性和挥发性，这使得生物样本中低丰度脂肪酸的精准分析成为代谢组学研究中的"卡脖子"难题。

针对这一技术瓶颈，内蒙古医科大学"蒙药学一流学科"建设项目支持的研究团队创新性地将化学衍生化与同位素标记策略相结合。研究人员设计出三甲基氨基乙酯(TMAE)衍生化方案，通过草酰氯活化脂肪酸羧基后，分别与普通碘甲烷(CH₃I)和氘代碘甲烷(CD₃I)反应，生成带有59 Da和62 Da特征中性丢失的FA-TMAE-h₃/d₃衍生物。这种"一石三鸟"的设计既将电离模式转为正离子增强灵敏度，又通过同位素编码实现内标校正，还能产生诊断性碎片提升定性能力。

关键技术路线包含三个核心环节：(1)建立四重中性丢失扫描(QNLS)非靶向筛查流程，通过匹配保留时间和59/62 Da质量差的峰对识别潜在FFAs；(2)采用重同位素标记的混合血清样本作为内标，开发多重反应监测(MRM)定量方法；(3)应用部分最小二乘判别分析(PLS-DA)解析不同饮食干预叙利亚金黄地鼠血清中FFAs的代谢特征。

【Derivatization efficiency】部分证实，该衍生化反应条件温和（每步5-10分钟），对C8-C22脂肪酸均保持稳定响应，衍生产物在ESI+模式下信号强度提升2-3个数量级。通过优化色谱条件，成功实现包括饱和脂肪酸(16:0)、单不饱和脂肪酸(18:1)和多不饱和脂肪酸(20:4)在内的23种FFAs基线分离。

【Results】显示，在普通饲料、高脂饮食(HFD)和非诺贝特治疗组的地鼠血清中，QNLS-MRM联用策略显著提高了低丰度FFAs的检出率。以同位素内标校正后，相对定量结果显示出良好的精密度（RSD<15%）。PLS-DA模型成功区分不同处理组，其中C18:3、C20:5等6种脂肪酸被鉴定为最具区分度的代谢标志物。

这项发表于《Journal of Chromatography B》的研究开创性地将稳定同位素衍生化(ID)与特征中性丢失扫描技术整合，突破了传统FFAs分析的灵敏度瓶颈。其技术优势体现在三个方面：首先，TMAE衍生化策略通过电荷反转大幅提升电离效率；其次，同位素编码的内标法有效克服基质效应；最后，59/62 Da双通道检测提供了可靠的定性依据。该工作不仅为心血管疾病脂代谢研究提供了新工具，其"衍生化-同位素标记-特征碎片诊断"的技术路线对其它低响应化合物的分析也具有重要借鉴意义。特别值得注意的是，研究中建立的相对定量方法仅需常规三重四极杆质谱即可实现，极大提升了技术在普通实验室的普适性，为临床代谢组学研究提供了可推广的解决方案。