基于多重实时PCR技术的亚洲型DEL变异快速检测方法开发及临床应用

为解决亚洲人群中RhD阴性个体中亚洲型DEL(RHD*01EL.01)变异检测的难题，韩国世基因医学基金会研究人员开发了一种新型多重实时PCR(mRT-PCR)检测方法。该研究采用等位基因特异性TaqMan水解探针技术，实现了对c.1227G>A突变的快速精准检测。经315例临床样本验证显示100%的敏感性和特异性，检测时间仅需100分钟，显著优于传统测序方法。该成果为输血安全和RhD同种免疫风险管理提供了高效工具，对优化东亚地区稀有血型资源管理具有重要意义。

　　

在东亚人群中，RhD阴性血型仅占0.15-0.34%，其中约16-32%实则为亚洲型DEL变异型——这种特殊变异会导致D抗原表达量极低（<22抗原/细胞），常规血清学方法难以检测。这种"伪阴性"现象给输血医学带来巨大挑战：若将DEL型血液误输给真阴性患者可能引发抗D抗体，而DEL型患者接受RhD阳性血液却可能安全无恙。传统检测方法如吸附-洗脱试验操作繁琐，Sanger测序耗时长达5小时，PCR-RFLP也需要3小时以上，均难以满足临床快速筛查需求。

韩国世基因医学基金会（Seegene Medical Foundation）的研究团队在《The Journal of Molecular Diagnostics》发表了一项突破性研究。他们创新性地开发出基于双引发寡核苷酸(DPO)和TaqMan-MGB探针技术的多重实时PCR(mRT-PCR)检测体系，仅需单管反应即可同步检测RHD基因、亚洲型DEL特征性突变(c.1227G>A)及内参基因HBB。研究采用315例临床样本（含180例RhD阳性、135例阴性/弱D）进行验证，通过合成DNA模板评估分析性能，并与PCR-SSP和Sanger测序进行方法学比较。

关键技术包括：1）针对RHD/RHCE基因反向排列特性设计特异性引物探针；2）采用DPO技术增强引物特异性；3）TaqMan-MGB探针优化短序列检测；4）建立三通道（FAM/VIC/Quasar670）同步检测体系；5）通过系列稀释实验确定检测限。

【分析性能】
合成DNA实验证实该体系可特异性识别RHD基因中的1227A/G变异，与RHCE基因无交叉反应。灵敏度测试显示可稳定检测低至10 fg的靶序列，临床样本检测限达1 ng/μL。

【临床验证】
在127例血清学RhD阴性样本中，精准识别出15例亚洲型DEL（11.8%）、102例RHD完全缺失（80.3%）和10例RHD-CE(2-9)-D杂合等位基因（7.9%）。与金标准Sanger测序相比，一致性达100%（κ=1.0），且发现1例1227G/A杂合变异。

【时效优势】
该检测将流程简化为单步PCR（95℃ 15min，58℃ 38循环），总耗时仅100分钟，较Sanger测序（310分钟）缩短68%，比PCR-RFLP（195分钟）减少49%。

这项研究的重要意义在于：首先，建立的mRT-PCR检测体系解决了亚洲型DEL鉴别诊断的技术瓶颈，其"样本进-结果出"的设计特别适合血站大规模筛查。其次，精准分型可避免DEL型献血者被误归为RhD阴性，降低真阴性受血者的同种免疫风险。再者，确认DEL表型的患者或可安全接受RhD阳性血液，缓解东亚地区D阴性血液供应压力。研究人员建议，未来可扩展该技术平台用于其他RHD变异检测，并通过多中心研究验证其在跨种族人群中的适用性。这项创新为输血医学实践提供了兼具精准性和高效性的分子诊断工具，对实现个体化输血具有重要临床价值。