通过计算方法鉴定出来自蓝细菌Calothrix sp.的一种新型热稳定α-淀粉酶

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：A Novel Thermostable α-Amylase from the Cyanobacterium Calothrix sp. Identified by Computational Approaches

蓝细菌来源α-淀粉酶的计算机分析与热稳定性评估，通过结构建模、序列比较及分子动力学模拟，发现Amy1蛋白在高温下保持稳定，为工业生物催化提供新资源。

　　

摘要

蓝细菌是一种光自养微生物，广泛存在于各种环境中，是具有工业应用价值的生物活性化合物的有希望的生产者。其中，α-淀粉酶能够水解淀粉中的α(1,4)糖苷键，生成可用于生物过程的可发酵单体。本研究采用计算方法，从公共数据库中的蓝细菌序列中识别并表征潜在的耐热α-淀粉酶。通过结构建模、序列比较、分子动力学模拟和结合自由能计算来分析和鉴定Amy1蛋白，以评估蛋白质-配体相互作用。在27°C和50°C下进行分子动力学模拟，以评估酶的稳定性，并为后续的实验验证提供指导。这些研究旨在确保实验测试的准确性，这对于确认其耐热特性至关重要。这些发现突显了蓝细菌α-淀粉酶作为商业替代品的潜力，并为未来的生物技术应用和大规模生产铺平了道路。

引言

蓝细菌是一类自养光合微生物，既存在于水生环境中也存在于陆地环境中。它们可能早在35亿多年前就出现在地球上，在塑造地球大气层方面发挥了重要作用[1]。根据系统发育分类法，蓝细菌被分为八个目：Gloeobacteriales、Synechococcales、Spirulinales、Chroococcales、Pleurocapsales、Oscillatoriales、Croococcidiopsidales和Nostocales[2]。这些微生物具有生产代谢产物的能力，对生物技术产业具有重大意义，应用领域包括生物燃料、染料、食品补充剂、生物肥料、生物聚合物、化妆品、水处理、纳米生物技术、医学应用和酶的生产[3]。其中Oscillatoriales和Nostocales目在生物活性代谢产物及其代谢途径方面的研究最为深入[4]。因此，蓝细菌作为一个不需要复杂培养基的光自养原核生物，成为了一个有前景的研究领域，适合用于可持续的绿色生物催化[5]。

淀粉酶属于糖苷水解酶家族，能够催化淀粉的分解，将其转化为可发酵的糖类。主要分为三种类型：α-淀粉酶，可水解α-1,4糖苷键，并能绕过α-1,6糖苷键；β-淀粉酶，可水解糖的非还原端处的α-1,4糖苷键；γ-淀粉酶，可水解α-1,6糖苷键及其他非还原键[6]。淀粉酶存在于植物、动物、细菌和酵母中，但由于微生物来源的淀粉酶具有较高的稳定性和适应性，因此在工业上应用最为广泛[7]。

α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是一种催化淀粉中α-1,4糖苷键水解的酶，利用钙离子作为辅因子，生成麦芽糖和葡萄糖等小分子糖[8]。它由三个结构域组成：A结构域（D-E-D催化结构域）、B结构域（钙结合区和环状区域）和C结构域（蛋白质的末端部分）。α-淀粉酶的分子量通常在40至70 kDa之间，由amy1基因编码。这类酶在食品、纺织、饮料、洗涤剂和造纸等行业中有广泛的应用[9]。它们的C末端结构附近存在保守区域，如β3和β4折叠片（其中一个D残基负责亲核攻击）、β5折叠片（含有参与质子转移的E残基）以及β7折叠片（第二个D残基在催化过程中稳定过渡态）。此外，靠近TIM桶的β2和β8折叠片有助于维持酶的结构完整性。这些保守区域中的大多数残基是非极性的，不应发生突变，因为这样的变化可能会影响酶的催化稳定性[10]。

在蓝细菌中，α-淀粉酶的活性已在Nostoc sp. PCC7119中被发现，其活性通过传统的生物测定方法进行了评估和表征。该酶的最适pH值为6.5至7.5，最适温度为31°C。这项研究证实了蓝细菌能够产生具有与其他细菌相同氨基酸序列的α-淀粉酶，尽管缺乏耐热性，但仍表现出优异的动力学常数。此前报道的耐热α-淀粉酶在高达50°C的温度下仍能保持活性[11]。本研究首次通过计算机模拟方法对蓝细菌产生的潜在耐热α-淀粉酶进行了表征，评估了酶-底物相互作用，并将其与两种已研究的酶进行了比较。

部分内容

筛选

首先，从NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库中以FASTA格式检索了丝状蓝细菌的基因组。随后，从dbCAN数据库中获取了GH13、GH57、GH119和GH126家族的α-淀粉酶序列[12]。这种方法旨在更高效便捷地识别具有优异性能的新酶[13]。

为了在这些菌株中鉴定α-淀粉酶，采用了同源性搜索方法

筛选

NCBI共享的数据表明，蓝细菌是代谢产物的丰富来源[25]。基于此，对获得的蓝细菌基因组进行了计算分析，特别是生物信息学分析，以寻找感兴趣的代谢产物。例如，在Paterson等人的研究中（2025年），使用了工具来筛选微藻中的蛋白质并进行功能分析[26]。因此，这种计算机模拟方法也可以应用于蓝细菌，通过搜索相关序列来进行分析

结论

在这项针对NCBI中丝状蓝细菌基因组的α-淀粉酶筛选研究中，从69株蓝细菌中鉴定出了Amy1蛋白（α-淀粉酶），共获得了184个潜在的α-淀粉酶氨基酸序列。其中35个序列与已描述的α-淀粉酶具有相同性，其三维结构也得到了验证，表现出良好的立体化学质量。虽然某些区域存在相似性，

CRediT作者贡献声明

Gabriel Albuquerque Xavier： 方法学研究、验证。Larissa Queiroz dos Santos： 方法学研究、验证。Alenna Crystiene Lima Farias de Sousa： 方法学研究、初稿撰写、审稿与编辑、概念构思。Evonnildo Costa Gon?alves： 项目管理、资金获取、监督、验证。Andrei Santos Siqueira： 方法学研究、监督、数据分析。Délia Cristina Figueira Aguiar： 项目管理

资助

本研究得到了帕拉州研究与发展基金会（FAPESPA）的资助（项目编号ICAAF 099/2014）。巴西国家科学技术委员会（CNPq）也通过研究资助311686/2015-0（ECG）为其中一位作者提供了支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

? 该作者是该期刊的编委会成员/主编/副主编/特邀编辑，未参与本文的编辑审查或发表决定。