EnvZ-OmpR通过酸性pH感知改变氢键网络变构激活毒力基因表达的分子机制

本研究揭示了MRE11-RAD50-NBS1/Xrs2（MRN/X）复合体中Xrs2的FHA结构域直接结合DNA的分子机制，通过NMR化学位移扰动和顺磁弛豫增强技术构建了DNA结合模型，发现其与磷酸肽结合位点重叠，为理解DNA双链断裂修复中Xrs2的多底物识别提供了结构动态框架。

　　

DNA双链断裂（DSBs）是基因组最致命的损伤类型之一，而MRE11-RAD50-NBS1/Xrs2（MRN/X）复合体作为细胞内的"第一反应者"，在DSBs修复中发挥核心作用。尽管MRE11和RAD50的DNA结合特性已被广泛研究，但NBS1/Xrs2的DNA结合机制长期未明。这一知识空白限制了人们对MRN/X复合体协同工作机制的理解，特别是在人类遗传病如共济失调毛细血管扩张样疾病（ATLD）和Nijmegen断裂综合征（NBS）中，NBS1突变导致的基因组不稳定性机制亟待阐明。

为解析这一科学问题，研究人员聚焦于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Xrs2蛋白的N端结构化区域（Xrs2³²⁵）。通过核磁共振（NMR）化学位移扰动（CSP）和顺磁弛豫增强（PRE）实验，首次发现Xrs2的FHA（Forkhead-associated）结构域存在DNA结合活性。结合HADDOCK分子对接技术，研究人员构建了DNA与Xrs2³²⁵结合的两种空间模型——平行和垂直取向，其中平行取向模型与突变验证数据更吻合。令人惊讶的是，该DNA结合位点与已知的磷酸化Sae2（pSae2）肽段结合区域高度重叠，揭示了FHA结构域"一区多用"的分子特征。

研究采用了多项关键技术：1）甲基特异性NMR技术追踪ILVM残基动态；2）PROXYL标记DNA的顺磁弛豫增强测定分子间距离；3）HADDOCK整合结构建模；4）电泳迁移率变动分析（EMSA）验证结合亲和力；5）荧光偏振法检测磷酸肽相互作用。这些方法的综合运用为弱相互作用体系的研究提供了范式。

【DNA binds to the FHA domain of Xrs2³²⁵】

通过¹³CH₃标记的甲基TROSY NMR技术，发现15bp发夹DNA引起FHA结构域多个残基（如10Leu、18Ile）化学位移变化，结合常数K_D≈0.75 μM。PRE数据进一步证实DNA主要接触FHA结构域表面带正电荷的环区。

【Model of pSae2 bound to Xrs2³²⁵】

磷酸化Sae2肽段（DFILpTQFDED）以K_D≈1.0 μM结合FHA结构域，其结合位点与DNA结合区域存在空间竞争，提示MRN/X复合体在DSBs位点可能存在底物选择机制。

【Validation of ligand-bound Xrs2³²⁵ structural models】

电荷反转突变体实验显示，K35E和R48E同时破坏DNA和pSae2结合，而K73E选择性影响DNA结合，为平行取向模型提供实验支持。

【Changes in Xrs2³²⁵ dynamics upon ligand binding】

甲基弛豫实验揭示配体结合使FHA结构域ps-ns时间尺度运动刚性增强，但μs-ms构象交换不受影响，否定了BRCT结构域"精氨酸开关"假说。

这项研究首次阐明：1）Xrs2/NBS1通过FHA结构域直接识别DNA，扩展了MRN/X复合体的DNA接触界面；2）发现DNA与磷酸肽竞争结合机制，为理解DSBs修复中信号通路的时序调控提供新视角；3）建立的整合结构生物学方法为研究弱相互作用体系树立典范。特别值得注意的是，FHA结构域作为公认的磷酸蛋白识别模块，其DNA结合能力的发现可能代表一类新型的核酸-蛋白相互作用范式，对开发靶向MRN/X复合体的抗癌药物具有重要指导意义。该成果发表于《Journal of Molecular Biology》，为染色体不稳定综合征的分子机制研究开辟了新途径。