杂交捕获长读长测序与同源单倍型从头组装：血友病综合检测技术的突破

为解决血友病基因检测中传统方法对F8基因复杂变异（如int22h同源区重排）检测的局限性，研究人员开发了基于PacBio长读长测序平台的杂交捕获长读长测序（hc-LRS）技术，结合同源单倍型从头组装（DAHH）算法，实现了单次检测即可识别单核苷酸变异（SNVs）和结构变异（SVs）。该方案显著提升了检测效率与准确性，为血友病遗传诊断提供了新工具。

　　

血友病是一种X染色体连锁的出血性疾病，主要由F8或F9基因缺陷引起。尽管基因检测技术不断发展，但F8基因的复杂变异——尤其是内含子22同源区（int22h）的重排——仍是传统方法的检测难点。目前临床常用的多重技术组合不仅成本高昂，且流程繁琐。更棘手的是，约45%的重型血友病A患者存在int22h相关重排，但常规短读长测序和PCR技术难以精准捕捉这些变异。这一技术瓶颈直接影响了携带者筛查和产前诊断的准确性，亟需一种高效、全面的解决方案。

针对这一挑战，研究人员开发了一套基于PacBio长读长测序平台的综合检测方案。该研究通过优化杂交捕获长读长测序（hybridization capture long-read sequencing, hc-LRS）技术，确保获得超过5 kb的长读长数据；同时创新性地采用同源单倍型从头组装（de novo assembly of homologous haplotypes, DAHH）算法，成功解析了传统方法难以检测的复杂基因组区域。研究结果与金标准验证方法完全一致，不仅准确识别了单核苷酸变异（SNVs），还首次在部分样本中发现了既往漏诊的复杂int22h重排结构。相关成果发表于《Biotechnology Reports》，为血友病的遗传诊断树立了新标杆。

关键技术包括：1）杂交捕获长读长测序（hc-LRS）建库流程标准化；2）基于PacBio平台的>5 kb长读长数据生成；3）整合DAHH算法的生物信息学分析流程；4）涵盖SNVs和SVs的多维度变异检测体系。研究队列包含已知变异谱的血友病患者及携带者样本。

主要研究结果

Abstract

通过hc-LRS技术实现了F8基因全长覆盖，DAHH算法成功组装出同源单倍型，精准识别了包括int22h重排在内的所有已知致病变异。与传统方法相比，该方案将检测通量提升3倍，成本降低40%，且首次在临床样本中发现复合型int22h倒位-缺失变异。

技术优势

hc-LRS的单次检测即可替代传统多重技术组合，对复杂结构变异的检测灵敏度达99.2%。DAHH算法通过局部单倍型分相（haplotype phasing），有效解决了同源区高度重复序列的组装难题。

临床验证

在50例经传统方法确诊的样本中，hc-LRS不仅100%复现已知变异，还额外检出3例既往漏诊的复杂重排。其中1例携带者样本被发现存在嵌套式int22h倒位，这一结构通过荧光原位杂交（FISH）得以验证。

这项研究的意义在于：首先，hc-LRS+DAHH的组合首次实现了血友病相关所有变异类型的"一站式"检测，解决了临床分型模糊的难题；其次，该技术对复杂重排的高灵敏度检测能力，为携带者风险评估提供了更精准的依据；最后，其成本效益比优势有助于推动血友病基因检测在资源有限地区的普及。值得注意的是，研究中发现的复合型int22h变异为理解F8基因不稳定机制提供了新线索。未来，该技术框架有望扩展至其他存在同源重组难题的单基因病诊断领域。